四君子汤防治D—半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究

广州中医药大学博士学位论文四君子汤防治D半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究姓名：孟辉申请学位级别：博士专业：中医基础理论指导教师：区永欣20060401中文摘要l 选题想路和研究目的随着人口老龄化的日益明显，如何延缓衰老，提高年老者的生活质量，已成为医学界研究的重大课题。近年来，中医药以“肾为先天之本”理论为指导，开展了大量研究工作，阐明了一些中医药抗衰老的机理。然而，衰老是一个多因素综合作用的复杂过程，其中脾作为“后天之本”对衰老过程的影响亦不容忽视。中医学对衰老的认识，早在黄帝内经时代就已有概说。黄帝内经对于人进入一定年龄阶段将必然衰老的原因和衰老发生机制，有较为全面的论述。内经提出：“女子七岁，肾气盛，齿更发长。五七，阳明脉衰，面始焦，发始坠。丈夫八岁，肾气实，发长齿更。八八，则齿发去。肾主水，受五脏六腑之精而藏之，故五脏盛乃能泻。今五脏皆衰，筋骨懈坠，天癸尽矣，故发鬓自，身体重，形步不正，而无子耳。”( 素问·上古天真论)“人生十岁，五脏始定血气已通，其气在下，故好走。七十岁，脾气虚，皮肤枯；百岁，五藏皆虚，神气皆去，形骸独居而终矣”。( 灵枢·天年) 等观点，明确认为，衰老将随增龄而必然发生，随增龄而自发的脏腑气血的生理病理变化为衰老的内在原因。脾胃虚损与衰老相关的学说源于内经，唐、宋、元、明、清诸医家，均对其有所发展。著名的补土学家李东垣将其重视脾胃的学术思想亦贯入到抗老延年的观点中，日：“凡有此( 脾胃) 病者，虽不易变生他疾，己损天年”，并主张“调理脾胃，老年当先“k 脾胃论) 。李中梓则提出了“先天之本在肾，后天之本在脾”的观点。张介宾日：脾肾“皆为五脏六腑之本”，“土为万物之源，胃气为养生之本是以养生家必以脾胃为先善养脾胃之道，所以便能致寿”( 景岳全书) 。吴昆日：“诸脏腑百骸皆受气于脾胃，而后能强，若脾胃一亏，则众体皆无以受气，日见蔽弱矣”( 医方考) 。龚廷贤日：“凡年老之人，当以养元气，健脾胃为主”( 衰老论) 。王文禄日：“是以养脾者养生之要也。”( 医先) 等等。总之，脾胃受到了普遍性的高度重视，并把这一重视脾胃的思想极大地贯入到抗老延年的理论指导和治法方药之中，并以之与补肾抗衰老相提并论，视之为抗衰老的两大最重要原则。现代研究表明，健脾法可通过不同环节对抗机体的衰老，其延缓衰老作用值得进一步探讨。本课题以健脾益气代表方四君子汤为研究手段，观察其对衰老小鼠模型m t D N A 缺失的影响，以期从基因水平探讨脾与衰老的关系，阐明健脾益气法延缓衰老的分子作用机制。研究结果将丰富中医“脾胃学说”理论的内涵，为延缓衰老提供新的思路和理论依据，并为开发研制抗衰老新药奠定理论基础。2 研究方法21 小鼠衰老模型的建立选用2 月龄昆明种小鼠随机分为6 组：正常对照组，模型对照组，维生素E( 2 5 0 m g ·k g ·d “) 组，四君子汤高( 2 0 9 ·k g ·d 1 ) 、中( 1 0 9 ·k g ·d 1 ) 、低剂量( 5 9 ·k g ·d 1 ) 组。D 一半乳糖亚急性衰老模型，水迷宫测试确定学习记忆障碍模型成立。22 观测指标22l 小鼠行为学观测一般状况观察及小鼠学习和记忆能力测试，造模前后各进行一次。222 小鼠脑组织N O 和N O S 含量的测定硝酸还原酶法测定N 0 含量；根据标准品吸光值，计算N O S 活性。2 23 谷光甘肽过氧化物酶( G S H P x ) 活性测定黄嘌呤氧化酶法测定S O D 活性，D T N B显色法测定G S H P x 。2 24 琥珀酸脱氢酶( s u c c i n a t ed e h y d r o g e n a s e ，S D H ) 比活性测定按试剂盒说明操作。225 小鼠海马组织线粒体D N A 缺失的测定P C R 扩增法。226F u r a 一2 A M 双波长荧光法测定小鼠海马钙浓度荧光分光光度计测定。227 透射电镜样品制各及观察透射电镜观察线粒体形态结构改变并摄片。2 28 脑细胞凋亡的检测方法流式细胞仪检测法。3 实验结果31 一般情况观察模型组小鼠大多数表现为毛发无光或脱落、精神萎靡、进食减少、行动迟缓、活动减少：部分小鼠可出现共济失调、自发运动增多或自我嘶咬等症状。药物治疗组小鼠也可在造模1 个月左右表现为与模型组类似的症状，但症状较轻，且这些症状在2月内逐渐减轻。空白对照组小鼠均未出现上述类似症状。32四君子汤对D 一半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用D 一半乳糖处理8 周时，模型组小鼠学习和记忆能力明显减弱，表现为学习和记忆阶段的游完全程时间明显延长，进入盲端的错误次数明显增加，与正常对照组小鼠比较具有明显差异( 只0 0 1 ) ，而四君子汤高剂量( S G ) 、中剂量( S Z ) 、低剂量( S D ) 及维生素E 处理后，明显缩短模型小鼠学习和记忆阶段游完全程时间和减少进入盲端的错误次数( P 6 1 0 h m 滤光镜检测，测定每样本计数1 0 0 0 0 个细胞，经计算机系统C e l lq u e s t 软件分析，绘制细胞数一D N A 分布图，计算正常二倍体峰前A O峰曲线下面积占整个分布曲线下面积的比例，即为凋亡细胞所占比例，用百分比表示。广州中医药大学2 0 0 6 届博士学位论文实验结果1 一般情况观察模型组小鼠大多数表现为毛发无光或脱落、精神萎靡、进食减少、行动迟缓、活动减少；部分小鼠可出现共济失调、自发运动增多或自我嘶咬等症状。药物治疗组小鼠也可在造模1 个月左右表现为与模型组类似的症状，但症状较轻，且这些症状在2月内逐渐减轻。空白对照组小鼠均未出现上述类似症状。2 四君子汤对D 一半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用见表lD 一半乳糖处理8 周时，模型组小鼠学习和记忆能力明显减弱，表现为学习和记忆阶段的游全程时间明显延长，进入盲端的错误次数明显增加，与F 常对照组小鼠比较具有明显差异( 尺0 0 1 ) ，而四君子汤高剂量( S G ) 、中剂量( S Z ) 、低剂量( S D ) 及维生素E 处理后，明显缩短模型小鼠学习和记忆阶段游完全程时间和减少进入盲端的错误次数( 尺O 0 1 ，P < O 0 5 ) 。表ls j z 对Dg a l 所致的小鼠学习记忆障碍的影响( i ±S )“P 00 1 s 对照纽比较：1 P < o 。0 5 , P o 。0 1s 模型纽比较结果分析：用D 一半乳糖诱致小鼠亚急性衰老模型，由于：D - g a l 经醛糖还原酶催化还原成半乳糖醇在细胞内堆积；D - g a l 经氧化酶催化氧化成半乳糖醛，进一步代谢为c O 。和木酮糖，伴随产生0 2 一和1 t 2 0 。其能够引起氧自由基损伤，使动物出现明显的智力低下和行为学异常。s j z 能对抗自由基引起小鼠学习记忆障碍，使给药小鼠造模后到达平台潜伏期无明显延长，提示四君子汤可能通过抗氧化作用改善自由基损伤而起作用。3 四君子汤对D 一半乳糖致学习记忆障碍小鼠脑组织N O 含量和N O S 活性的影响见表2四君子汤防治D 一半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究D 一半乳糖处理8 周时，模型组小鼠脑组织中N O 含量及N O S 活性明显高于正常对照组小鼠( P < 0 0 1 ) ，而四君子汤高剂量( S G ) 、中剂量( S Z ) 、低剂量( S D ) 及维生素E 处理后，模型小鼠脑组织中N O 含量和N O S 明显降低( P < O 0 1 ，P < O 0 5 ) 。表2S J Z 对D - g a l 所致学习记忆障碍小鼠脑组织N O 含量和N O S 活性的影响( i ±s )“P < O 0 1s 对照组比较；P < O 0 5 “P < O 。0 1s 模型组比较结果分析：D 一半乳糖致小鼠亚急性衰老模型组，脑组织N 0 含量及N O S 活性明显升高，而受试药物组小鼠经四君子汤连续灌胃4 2 d 后，N O 含量及N O S 活性显著降低，学习记忆能力得到显著改善，提示四君子汤可以通过减少N O S 的激活，阻止N O 过量生成，进一步减轻自由基对神经元的损伤。提示四君子汤能显著改善衰老小鼠学习记忆障碍，其作用可能与调节大脑组织N O N O S 水平有关。4 四君子汤对D 一半乳糖诱致学习记忆障碍小鼠脑内G S H - P x 和S D H 活性的影响见表3D 一半乳糖处理8 周时，模型组小鼠脑组织中G S H P x 和S D H 活力明显低于正常对照组小鼠( P ( O 0 1 ) ，而四君子汤高剂量( s G ) 、中剂量( S Z ) 、低剂量( S D ) 及维生素E 处理后，模型小鼠脑组织中G S H P x 和S D H 活力明显升高( P < O 0 1 ，( P ( O 0 5 ) 。表3S J Z 对D - g a l 诱致学习记忆障碍小鼠脑内G S H P x 和S D H 活性的影响( 牙±s )广州中医药大学2 0 0 6 届博士学位论文“嘲0 1s 对照缀比较l K Q 0 5 。“嘲叭与模型纽眈较结果分析：s J Z 在显著改善D 一半乳糖致亚急性衰老小鼠被动回避记忆能力及空间学习记忆能力的同时，可显著提高小鼠大脑组织G S H P x 与S D H 活性，提示s j z 抗氧化效应可能是其发挥抗衰老作用的重要机制之一。5 四君子汤对D 一半乳糖诱致学习记忆障碍小鼠海马神经细胞内钙离子浓度的影响图27 0 06 0 05 0 04 0 03 0 02 0 01 0 0结果分析：模型组小鼠海马神经细胞内C a 2 + 浓度增加，引起C a 2 + 超载，破坏线粒体的结构和功能，加重自由基损伤，对中枢神经系统的影响尤为明显。而受试药物组C a 2 + 浓度显著降低，提示四君子汤可能通过降低钙离子浓度，减少钙超载，降低自由基损伤。6 四君子汤对小鼠脑海马神经细胞线粒体损伤时D N A 突变的影响见图36 1P C R 扩增经D 一半乳糖制作的小鼠衰老模型，提取总D N A 后，以L 1 H 为引物对，进行P C R 扩增，所有海马标本均可见O 4 7k b 片断的一个条带，其中模型组小鼠扩增出另一个约0 6 3k b 片断的条带( F i g A ) 。说明模型组小鼠海马m L D N A 中存在着约3 8 7k b 片断缺失。图3 四君子汤对小鼠脑海马神经细胞线粒体损伤时D N A 突变的影响( i ±J )一co薹ju一四君子汤防治D 一半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究6 0 0 b p0 6 3 珏 4 0 0 b p0 4 T n2 0 0 b pI23H456M ：M a r k e r1 S h a m2 S Z3 V i t E4 S D5 S G6 M o d e l注：0 6 3 K b 为m t D N A 发生3 8 6 7 b p 片段缺失后出现的P C R 产物，0 4 7 K b 为无片断缺失出现的P C R 产物。6 2P C R 产物正确性确定以L 2 H 为引物对，所有标本均有0 4 7k b 片断的一个条带，无另一个条带，说明在以L 1 M 为引物对时所扩增出的O 6 3k b 片断不是由引物退火错误所产生。结果分析：模型组和四君子汤低剂量组小鼠海马m t D N A 中存在着约3 8 7k b 片断缺失。四君子汤高、中剂量组未见缺失片断，提示四君子汤可能有防治D 一半乳糖诱致小鼠脑细胞线粒体损伤的保护作用7 电镜各组小鼠电镜下神经元及线粒体超微结构的观察正常组海马神经细胞超微结构正常( 见图4 ) 。细胞轮廓清晰，细胞膜完整，双层结构清晰，细胞核呈圆形和卵圆形，核膜完整，核仁清晰，染色质分布均匀。细胞浆中线粒体数量很多，分布密集，大多数呈圆形或卵