205编号WB实验步骤详解
2页1、 Western 实验步骤实验步骤 Western, 也称 Western blot、 Western blotting、 Western 印迹, 是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的 Western 及 IP 细胞裂解液(P0013)、RIPA 裂解液等,裂解贴 壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体 蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使 用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和 还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的 Western 及 IP 细胞裂解液或 RIPA 裂解液,可以使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(
2、P0009/P0010/P0011/P0012)。 2. 电泳电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE 凝胶配制 SDS-PAGE 凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 (P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度 SDS-PAGE 的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如 2X 或 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上 样缓冲液。使用 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更 多的蛋白样品。5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 100或沸水浴加热 3-5 分钟,以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果, 以及判断蛋白分子量大小, 最好使用预染蛋白质分子量标准(P0
3、066)。 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 电泳液(P0014A/P0014B)。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于 Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置, 低电压可以设置在 80-100V, 高电压可以设置在 120V 左右。 SDS- PAGE 可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了 电泳方便起见,也可以采用整个 SDS-PAGE 过程恒压的方式,通常把电压设置在 100V,然后设定定时时 间为 90120 分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳, 或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况, 预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3. 转膜转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。 硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用, 但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考
《205编号WB实验步骤详解》由会员玩***分享,可在线阅读,更多相关《205编号WB实验步骤详解》请在金锄头文库上搜索。
零售店员的支付方式指导培训
超市POS机操作培训指南
百货公司市场调研与分析培训
发掘创意潜力的艺术与文化创新培训方案
艺术与文化行业中的卡通与插图设计
管理咨询行业的商业谈判技能培训
魅力之光:眼妆技巧
航空制造行业飞行器制造与装配培训
美食与美容:饱食和美丽的双重享受
管理咨询行业的商业谈判与培训
生物技术行业的生物工程与生物制造技术培训
美食与美容:事半功倍
电子产品零售商人员培训:团队合作与沟通技巧
推动个性化定制服装行业的人才培训与技术创新
强化艺术与文化行业人才的园林与景观设计能力
电子产品零售商店员:建立卓越的购物体验的培训
生命科学行业人才培养生态农业与有机农业
生命科学行业中的商业战略培训
折扣店人员培训:陈列设计与效果促销技巧提升计划
掌握建筑规划设计核心知识的培训班
2024-01-03 50页
2024-01-03 57页
2023-12-29 56页
2023-12-19 80页
2023-12-19 371页
2023-12-15 43页
2023-12-15 14页
2023-12-15 30页
2023-12-15 28页
2023-12-15 16页