205编号WB实验步骤详解

Western 实验步骤实验步骤 Western， 也称 Western blot、 Western blotting、 Western 印迹， 是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的 Western 及 IP 细胞裂解液(P0013)、RIPA 裂解液等，裂解贴 壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体 蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使 用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和 还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的 Western 及 IP 细胞裂解液或 RIPA 裂解液，可以使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。 2. 电泳电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE 凝胶配制 SDS-PAGE 凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 (P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度 SDS-PAGE 的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如 2X 或 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上 样缓冲液。使用 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更 多的蛋白样品。5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 100或沸水浴加热 3-5 分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果， 以及判断蛋白分子量大小， 最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的 SDS-PAGE 电泳液(P0014A/P0014B)。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于 Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置， 低电压可以设置在 80-100V， 高电压可以设置在 120V 左右。 SDS- PAGE 可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了 电泳方便起见，也可以采用整个 SDS-PAGE 过程恒压的方式，通常把电压设置在 100V，然后设定定时时 间为 90120 分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳， 或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况， 预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3. 转膜转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。 硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用， 但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推 荐使用步骤。 通常如果使用 Bio-Rad 的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为 300-400mA，转膜时间为 30-60 分钟。 也可以在 15-20mA 转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时 间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小， 需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中 进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的 1-2 条带较难全部转到膜上。 转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快 速染色液(P0017)对完成转膜的 SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4. 封闭封闭(Blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的 Western 洗涤液(P0023C)中，漂洗 1-2 分钟，以洗去膜上 的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液，加入 Western 封闭液(P0023B)，在摇床上缓 慢摇动,室温封闭 60 分钟。对于一些背景较高的抗体，可以 4封闭过夜。在整个 Western 过程中我们推荐 使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。 5. 一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用 Western 一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或 4在侧摆摇床上缓慢摇动孵 育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以 4缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵 育温度和时间。 回收一抗。加入 Western 洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加 入洗涤液洗涤 5-10 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 注 ： Western 结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用 Tubulin 抗体(AT819)或 Actin 抗体(AA128)， 进行内参检测。 6. 二抗孵育二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书， 按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的 IgG，则二抗需选择抗小鼠 IgG 的二抗，如辣根过氧 化物酶标记山羊抗小鼠 IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多种二抗提供。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或 4在侧摆摇床上缓慢摇动孵 育一小时。 回收二抗。加入 Western 洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加 入洗涤液洗涤 5-10 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 7. 蛋白检测蛋白检测(Detection of proteins) 参考相关说明书，使用 BeyoECL Plus(P0018)等 ECL 类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒 (FFC58/FFC83)进行。 洗片时可以使用 X 光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配 制显影液和定影液进行手工洗片。X 光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达 X-OMAT BT 胶片 (FF057/FF081)。 8. 膜的重复利用膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用 Western 一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。