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nothern blot操作步骤及使用方法

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卖家[上传人]：lxl15****05027

文档编号：136113323

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1、Northern Blot操作方法一实验器具（灭菌两次）和试剂试剂配置： 20 SSC： 3M Nacl 175.5g, 0.3M 柠檬酸钠 88.23g, pH 7.0 马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15M Nacl (用NaOH调pH到7.5,1L约加8g固体) 洗涤缓冲液：马来酸缓冲液+0.3% Tween20, 作用是去除未结合的抗体检测缓冲液：0.1M Tris-Hcl, 0.1M Nacl, pH9.5Southern 和Northern 所用的试剂盒为：含有甲醛的凝胶（1.0%）称取1.0g琼脂糖，加入100ml 1MOPS中，加热融化后冷却至约60，加入10ml甲醛，摇匀后倒入制胶槽。10 MOPS电泳缓冲液：0.2M MOPS(PH7.0) (MW.209.27)20mM NaAc(MW.82.03)10mM EDTA(PH8.0)将20.9g的MOPS溶解于350ml的DEPC处理的水中，用2M的NaOH 调PH到7.0，加10ml DEPC处理的1M NaAc（4.10g/50ml）和10 ml DEPC处理的0.5MNa2 EDTA（9.03g/50ml

2、）(PH8.0),用DEPC处理水定容到500ml，过滤灭菌。RNA用trizol法提取二 Northern 杂交膜的制备1.6RNA loading buffer（1ml）：甲酰胺 500l 甲醛 175l 甘油 200l Na2EDTA 2.5l溴酚蓝枪头蘸取 1xMOPS 122.5l二甲基苯蓝枪头蘸取1 RNA样品使用前80处理15min（变性）。2 加入加样缓冲液(2倍体积于上样量)，每泳道点样量为30l，50V电压下电泳约2.5小时。（中途观察RNA有没有降解）（3 溴酚兰距前沿1-2cm时停止电泳。）4 上样凝胶用20SSC中浸泡20分钟，尼龙膜先用DEPC水短暂浸润，然后在20SSC浸泡5min。5 以20SSC做转膜缓冲液，利用毛细管洗脱的方法将RNA转移至Hybond+尼龙膜上。6 转膜16-18小时，结束后，反转膜（与胶接触的一面），用铅笔在角落处做标记。7 室温晾干30分钟以上，待膜干燥后用254nm U.V交联两次，每次30S，以固定RNA与膜的结合，将膜用保鲜膜包裹后，贮存于-20备用。cDNA探针的制备探针的标记采用Roche公司的地高辛试剂盒：1

3、）以目的基因做探针为例，PCR扩增目的基因作为探针（长度必须大于25bp，若目的基因较长，可选取其中一段做探针），注意胶回收的浓度，1g样品不超过8l；2）将胶回收的探针模板取1g左右于PCR管中；3）沸水浴10min，之后立即转入到冰水混合物中；4）向其中加入2l地高辛高效引物混合物（试剂1），混匀，微离心，37 温浴10h-20h左右； 5）100加热10min终止反应后探针可直接使用。Northern 杂交程序将RNA膜浸入52预热的预杂交液Church buffer中（预杂交液的加入量以刚好没过膜为宜），预杂交4小时(一般早上预杂交到晚上，预杂交的目的是封闭膜上能与DNA探针结合的位点)；将标记并变性的cDNA探针加入预杂交液中，52杂交过夜；次日按下列操作依次洗膜；冷洗液 1L 热洗液 1L2X SSC 100ml 20X SSC 0.1X SSC 5ml 20X SSC0.1% SDS 10ml 10% SDS 0.1% SDS 10ml 10% SDS1）冷洗 2 SSC / 0.1% SDS（室温）5分钟x2次2）热洗 0.1 SSC/0.1%SDS （68） 15分钟x2次（热洗液要提前预热）3）洗涤缓冲液 5分钟x3次4）马来酸缓冲液泡 3min封阻抗体封闭液：用马来酸缓冲液将10的Blocking solution稀释至1。取20ml 1封闭液于杂交管中，将尼龙膜放入（正面朝上），在杂交仪中常温封闭1h,向20ml封闭液中加入1l抗体（4号管使用前10000g微离心5s），在杂交仪中常温30min.洗抗体取出尼龙膜，用Washing buffer 洗三次，每次15min;再将膜在检测缓冲液中浸泡2min.加底物取100l底物（5号管）用检测缓冲液稀释至5ml. 尼龙膜放在大培养皿中，暗处理过夜。

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