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细胞因子检测参考课件

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1、细胞因子的检测方法左大明zdaming 细胞因子一类由细胞分泌具有多种功能的高活性小分子蛋白参与免疫调节和多种生理病理过程等白细胞介素 interleukin IL 干扰素 interferon IFN 肿瘤坏死因子 tumornecrosisfactor TNF 集落刺激因子 colonystimulatingfactor CSF 生长因子 growthfactor GF 趋化因子 chemokine 细胞因子的检测方法待检样品细胞上清指示细胞 CTLL 2 IL 2依赖细胞系按不同稀释度加入 37 C 16 20小时加入3HTdR 1 5 Ci 37 C 4 6小时收集细胞测定细胞增殖实验细胞病变抑制实验待检样品细胞上清 IFN 指示细胞 wish 按不同稀释度加入 37 C 4小时 37 C 24 48小时弃取上清加入VSV 水泡性口炎病毒观察细胞病变镜检或比色 UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferation SDM SDM Glivec CalculationofProliferativeIndex

2、P I CFSE 43210 TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments CellProliferationELISAKit BrdU colorimetric Chromium 51 51Cr releaseassays 计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化实验示意图微孔滤膜用示踪物质标记抗体或抗原使其与相应的抗原或抗体反应使微量的不可见的反应成为可见的或可测定的免疫标记技术高通量细胞因子检测CBA CytometricBeadArray 是一种微珠多用途检测分析技术它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液 EDTA血浆血清样本中被检测物质的量其采用夹心法分析策略与传统的ELI

3、SA分析技术相比此方法可以同时检测多项指标用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度此分析方法不受样本量的限制而且可以得到一个样本的多个数据 Cytokinenetwork CBA原理示意图 LabInvest2003 83 1131 1146 cytokinebeadarrays CBA ELISPOT 酶联免疫斑点实验 ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子实验中每个斑点 spot 是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域代表一个活性淋巴细胞它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力优点灵敏度高是目前为止最灵敏的检测技术可检测到百万分之一阳性细胞率单细胞水平活细胞功能检测操作简便可进行高通量筛选 1 特异性单抗包被在培养板孔底部 2 封闭能结合单抗的其他部位 3 加入细胞及刺激物培养阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获 4 移出细胞洗涤 5 加入生物素标记的二抗 6 加入酶标链霉亲和素 7 加入显色底物在酶的催化分解下产生不可溶的色素就近沉淀在局部的膜上形成斑点 8 斑点计数

4、可人工计数也可用自动读板仪计数数据处理结果分析 ELISPOT 应用移植研究 allograftrejection疫苗开发亦可评估疫苗效力或是疫苗注射路径影响Th0 Th1 Th2细胞转换分析自体免疫研究免疫调节及免疫治疗研究癌症研究肿瘤反应T细胞作用过敏机制探讨 IL 4诱导免疫球蛋白亚型转换其它参与过敏机制之细胞因子的研究传染疾病研究 Lymedisease Chlamydiainfections Helicobacterpyloriinfections HIVinfections multiplesclerosis 等 Medium PHA Peptide1 Peptide21 Peptide47 GzB HIV peptiderecallpatientB IFN g HIV peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN gandGzB KleenT etal AIDS2003 18 383 392 ELISPOT和ELISA的区别 ELISPOT法源自ELISA 又突破传统ELISA

5、法是定量ELISA技术的延伸和新的发展它们最大的不同 1 ELISA通过显色反应在酶标仪上测定吸光度与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量整体水平 ELISPOT也是通过显色反应在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数 1个斑点代表1个细胞从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率单细胞水平 2 ELISPOT比ELISA更敏感 ELISPOT技术应用领域自身免疫诊断和预后分析器官移植后排斥反应的预测过敏性疾病脱敏治疗的监测疫苗和药品的研发与检测等胞内细胞因子的检测 LPS活化单核细胞内TNF 的测定R1 淋巴细胞 R2 单核细胞 TNF 的诱生和检测主要由单核巨噬细胞及其他多种细胞产生能使杀伤肿瘤细胞 THP 1 人单核细胞系在LPS 脂多糖刺激下可分泌TNF L929 小鼠成纤维细胞可被THP 1分泌的TNF 杀伤且细胞的死亡率与TNF 活性成正比四甲基偶氮唑盐 MTT 在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶的作用下被还原呈蓝黑色的MTT 甲瓒离心收集培养上清加入加入四甲基偶氮唑盐 MTT 37 C 5 CO2 LPS 18 24h 放线菌素D处理 37 C 5 CO2 18 24h 37 C 5 CO2 4 6h 吸出上清加入DMSO 测OD570 TNF 的诱生和检测

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