第三章 细胞生物学研究方法yooc（三月）.me

1、第11章发酵产物的提取与精制 发酵产物的提取与精制属于发酵工程的下游加工技术 下游加工亦称发酵后处理 是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程 在多数情况下是从稀的发酵液中回收目的产物 整个过程有多项单元操作组成 其中有许多是经典的化工单元操作 9 1下游加工过程概述 一 下游加工过程的重要性 1 获得商业产品的关键环节 2 促进发酵工程上游加工技术或工艺的改进 3 拥有市场竞争力的重要保证 二 下游加工工程的一般流程 1 粗分离阶段 1 发酵液的预处理和固 液分离 2 产物的初分离 2 纯化精制阶段 3 产物的高度纯化 4 成品加工 预处理 破碎细胞 碎片分离 细胞分离 精制 成品加工 F发酵液 提取 加热沉降均化离心分离沉淀层析无菌过滤调pH离心分离研磨萃取吸附离子交换浓缩絮凝过滤溶胞超滤萃取亲和超滤膜分离双水相萃取超滤憎水冷冻干燥吸附喷雾干燥电泳结晶 发酵液 胞外产物 操作步骤减至最少 并尽可能提高各步骤的收率 一 发酵液的一般特征1 含水量高 一般可达90 99 处理体积大 2 产品浓度低 3 悬浮物颗粒小 密度与液体相差不大 4 固体粒子可压缩性大 一压缩就变

2、形 5 液体黏度大 大多为非牛顿型流体 易吸附在滤布上 6 产物性质不稳定 不耐热 等会酸碱敏感 易被氧化 易被微生物污染及酶分解 9 2发酵液的预处理与固 液分离 二 发酵液预处理的目的和要求1 预处理的目的 1 改变发酵液的物理性质 促进悬浮液中分离固形物的速度 提高固液分离器的效率 2 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 多数是液体 3 去除发酵液中部分杂质 以利于后续各步操作 2 发酵液预处理的要求 1 菌体的分离 2 固体悬浮物的去除 3 蛋白质的去除 4 重金属离子的去除 5 色素 热原质 毒性物质等有机杂质的去除 6 改变发酵液的性质 7 调节适宜pH值和温度 三 发酵液预处理的方法 1 降低液体的黏度2 絮凝法3 重力法4 等电点法5 加入助滤剂6 缴入反应剂 1降低液体黏度 1 加水稀释法采用加水稀释法虽然能降低液体黏度 但是会增加发酵液的体积 因此加大后续过程的处理量 而且稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才算真正有效 即若加水一倍 则稀释后液体的黏度必须下降50 以上 才能有效提高过滤效率 2 加热法 升高温度可以降低悬浮液的黏度 除去某些杂蛋白 降低悬浮

3、物的最终体积 破坏凝胶状结构 增加滤饼的空隙度 提高过滤效率 不适用热敏性的物质 而且要防止加热导致细胞溶解 胞内物质外溢 3 添加酶制剂 比如 加酶将多糖转化为单糖 凝聚是在高价无机盐作用下 由于双电层排斥电位的降低 而使胶体体系不稳定的现象 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下 基于架桥作用 使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 是一种以物理的集合为主的过程 凝聚和絮凝的概念 扩散双电层的结构模型图胶粒能保持分散状态的原因 2 凝聚和絮凝法 凝聚技术 扩散双电层的结构模型图 凝聚原理 电解质将胶体粒子表面上的电荷中和 减少存在于胶体粒子间的静电斥力 使范德华力占优势 这样胶体就会凝聚成较大 较密实的粒子 胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构 一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时 即产生使两个粒子分开 从而阻止了粒子的聚集 电位越大 电排斥作用就越强 胶粒的分散程度也越大 此外 由于胶粒表面的水化作用 形成了包围于粒子周围的水化层 也能阻碍胶粒间的直接聚集 但是 水化膜主要是伴随胶粒带电而引起的 一旦 电位降低或消除 水化层也会随之减弱或消失 常用的凝

4、聚剂Al2 SO4 3 18H2O AlCl3 6H2O FeCl3 ZnSO4 MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为 Al3 Fe3 H Ca2 Mg2 K Na Li 常用的凝聚方法 在稀溶液中加入电解质以促进凝聚 试剂包括酸 碱 简单电解质和合成的高分子电解质 絮凝原理 在某些高分子絮凝剂存在下 基于架桥作用 使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤 絮凝剂通过静电引力 范德华引力或氢键的作用 强烈地吸附在胶粒的表面 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上 产生桥架连接时 就形成了较大的絮团 这就是絮凝作用 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物 其相对分子质量可高达数万至一千万以上 长链状结构 其链节上含有许多活性官能团 包括带电荷的阴离子 如 COOH 或阳离子 如 NH2 基团以及不带电荷的非离子型基团 常用的絮凝剂 明胶 甲基纤维素 多聚丙烯酸 聚胺衍生物 氯化钙 磷酸氢二钠 3 重力法 在工业上用的较多的主要是离心和过滤 过滤常用板框真空吸滤或电动筛等 离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素 一般温度高 压力大 发酵液粘度小 滤布选用适当 助溶剂适宜 搅拌

5、都可以提高过滤速度 4 等电点法 蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中 胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关 蛋白质在某一pH下 净电荷为零 溶解度最小 称为等电点 因此可利用此特性分离或去除良性物质 因为羧基的电离度比氨基大 故蛋白质的酸性性质通常强于碱性 因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内 pH4 0 5 5 5 添加助滤剂 一般为惰性助滤剂 是一种颗粒均匀 质地坚硬 不可压缩的粒状物质作用 助滤剂表面具有吸附胶体的能力 并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构 不可压缩 滤孔不会被全部堵塞 可以保持良好的渗透性使用方法 1 在滤布上预涂 作为过滤介质使用 2 按一定比例混入待滤的悬浮液中常用的助滤剂 硅藻土 膨胀珍珠岩 石棉 纤维素 未活化的碳 炉渣 重质碳酸钙 6 添加反应剂 添加可溶解的盐类 生成不溶解的沉淀 生成的沉淀能防止菌丝体粘结 使菌丝具有块状结构 沉淀本身可作为助滤剂 还能使胶状物和悬浮物凝固 四 发酵液的相对纯化 1 高价无机离子的去除 Ca2 Mg2 Fe2 等 2 可溶性杂蛋白的去除 高价无机离子的存在 会影响树脂对生化物质的交换容量 杂蛋白质的存在 不仅在采用

6、离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力 而且在采用有机溶剂或两水相萃取时 容易产生乳化 使两相分离不清 在预处理时 应尽量除去这些物质 1高价无机离子的去除 发酵液中杂质很多 其中对提炼影响最大的是高价无机离子 Ca2 Mg2 Fe2 等 去除钙离子 通常使用草酸 但由于草酸溶解度较小 不适合用量较大的场合 可用其可溶性盐 草酸价格昂贵 注意回收 去除镁离子 加入三聚磷酸钠 与镁离子形成络合物 用磷酸盐处理 也能大大降低钙离子和镁离子的浓度 例如 环丝氨酸的提取 去除铁离子 可加入黄血盐 使其形成普鲁士蓝沉淀而除去 2 杂蛋白质的除去 1 沉淀法 加热变性蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过程称为变性 使蛋白质变性的方法有 加热 调节pH 加酒精等有机溶剂或表面活性剂等 在链霉素生产中 在pH3 0时 加热至70 75 维持30min 黏度降为1 6 过滤速度提高3倍 变性法的局限性 加热法只适合于对热较稳定的目的产物 极端pH也会导致某些目的产物失活 并且要消耗大量酸碱 而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合 加有机溶剂 表面活性剂 酸碱等在酸性溶液中 蛋白质

7、能与一些阴离子 如三氯乙酸盐 水杨酸盐 钨酸盐 苦味酸盐 鞣酸盐 过氯酸盐等形成沉淀 在碱性溶液中 蛋白质能与一些阳离子如Ag Cu2 Zn2 Fe3 和Pb2 等形成沉淀 2 吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去 例如 在枯草芽孢杆菌发酵液中 加入氯化钙和磷酸氢二钠 两者生成庞大的凝胶 把蛋白质 菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去 从而可加快过滤速率 9 3固 液分离过程及设备简介 意义 固 液分离过程下游加工的重要环节 用于发酵液的预处理和生物产品的纯化 精制等环节 方法 常用的方法有过滤 离心 此外还有膜分离 双水相萃取和扩张床吸附等方法 影响发酵液固 液分离的主要因素 菌体的大小 形状及发酵液的黏度 还有发酵液的温度 pH值 加热时间等 目的 收集胞内产物的细胞或菌体 分离除去液相 或者是收集含生化物质的液相 分离除去固体悬浮物 如细胞 菌体 细胞碎片 蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等 1 过滤 定义 用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程 常用的过滤方式 加压过滤和真空过滤 典型设备主要有 板框压滤机和鼓式真空过滤机 1 板框过滤机 板框压滤机由压滤机滤

8、板 液压系统 压滤机框 滤板传输系统和电气系统等五大部分组成 真空转鼓过滤机 优点 真空转鼓过滤机具有自动化程度高 操作连续 处理量大 特别适合固体含量大 10 的悬浮液的分离 在发酵工业中广泛用于霉菌 放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离 缺点 由于受真空度的限制 不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤 且过滤所得固相的干度不如加压过滤 2 离心 定义 基于固体颗粒和周围液体密度存在差异 在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程 离心分离方法 1 差速离心 工业上最常用的离心分离方法 定义 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心 用于分离不同大小的细胞和细胞器 对象 混合样品中各沉降系数差别较大的组分 速度逐渐提高 样品按大小先后沉淀 原理 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部 通过重力或离心力场的作用使细胞分层 分离 分类 1 移动区带离心2 等密度离心常用密度梯度物质 蔗糖 甘油 CsCl NaBr 2 密度梯度离心 多用于生化研究 1 移动区带离心 含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时 每种颗粒都达到其最大沉降

9、速度 这时样品开始分离 离心管的上层逐渐形成透明的上清液 并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面 界面的移动相对于每种组分来说是特征的 用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 此法所采用的介质密度较低 介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度 2 等密度离心 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处 并停留在该层达到平衡 从而将不同密度的细胞或细胞器分离 离心机分类 制备性离心机 分析性离心机 超速离心机 普通离心机 高速冷冻离心机 超速离心机 实验型离心机 工业型离心机 碟片式离心机是传统离心机 为目前工业上应用最广泛的离心机 分离因数可达1000 20000 最大处理量达到300m3 h 常用于大规模的分离过程 适用范围细菌 酵母菌 放线菌 细胞碎片 管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备 其转鼓细长 可在15000 50000的高转速下工作 分离因数可达104 6 105 它设备简单 操作稳定 适用范围细胞 细胞碎片 细胞器 病毒 蛋白质 核酸等 3 其他固 液分离方法 1 膜分离 利用不同组分通过膜的传递速度

10、不同而得以分离的方法 2 双水相萃取 利用不同组分在双水相分配系数不同进行分离方法 3 扩张床吸附 将固 液分离合目的产物吸附合并成一步进行的一种分离方法 11 4微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物如果是胞内物质 如有些酶制剂 干扰素 胰岛素等 那么首先要收集菌体 进行细胞破碎 1 微生物细胞壁的组成与结构 1 细菌细胞壁 2 酵母菌细胞壁比G 菌稍厚 主要成分是葡聚糖 甘露聚糖和蛋白质等 3 其他真菌细胞壁主要由多糖组成 如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高 2 常用的细胞破碎方法 细胞破碎的方法很多 根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类 亦可按所用方法的属性分为物理法 化学法和生物法三类 物理破碎法 高压匀浆法 挤压法 高速珠磨法 超声波法 化学破碎法 渗透冲击法 增溶法 生物破碎法 酶溶法 细胞破碎机理图 11 5浓缩技术 浓缩过程是发酵工业提取与精制过程常用的单元操作 浓缩的目的是将低溶质浓度的溶液通过除去溶质变为高溶质浓度的溶液 它广泛用于有机酸 氨基酸 核苷酸 酶制剂及抗生素等发酵工业产品的提取分离过程 常用的浓缩技术有蒸发浓缩法 冷冻干燥法 吸收浓缩法 1 蒸

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