第5章 生物反应器

1、第五章 生物反应器,目 录,第一节 生物反应器的基本知识,第二节 培养基预处理设备,第三节 菌种制备设备,全国高等学校高职高专药品类专业卫生部“十一五”规划教材生物制药设备,第四节 发酵设备,第五节 动植物细胞培养设备,学习目标,学习目的 学习生物反应器的结构和工作原理，培养生物反应器操作技能，为发酵操作、细胞培养操作打下知识和技能基础。 知识要求 掌握机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐、鼓泡塔式发酵罐、膜反应器的结构； 熟悉机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐、常用动植物细胞培养器的工作原理； 了解灭菌、无菌操作基本原理，了解生物反应器参数检测与自动控制原理；了解参数检测仪器的工作原理。 能力要求 熟练应用机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐的基本操作技术； 学会培养基灭菌与无菌操作。,生物反应在狭义上是指活细胞中的各种生物化学反应。广义的生物反应是指生物体的新陈代谢过程。,一、生物反应过程,（一）概述,第一节 生物反应基本知识,1.生物反应,2.影响生物反应的因素,环境温度、酸碱度、营养物质浓度、 氧气浓度、二氧化碳浓度、机械尺寸、 流体湍流程度、细胞的生长浓度、产 物的生成速度等,2.提高

2、氧气传递速度的途径,双膜理论 气液界面上的传质 阻力主要集中在气 膜和液膜的滞流底 层，滞流底层越厚 阻力越大，液体的 黏度越大，滞流底 层越厚，传质阻力 也越大,（2）提高通气速率,通气量越大，反应液中的气泡就越多，溶解氧的浓度就越高。通气能起到一定的搅拌效果。,通气量过大，则容易产生大量的泡沫，造成溢罐，产生气泡“过载”现象。,（3）控制反应液体积,在同样搅拌强度下，反应液体积增大，会降低搅拌的效果 。,（4）改善反应液的性质,反应液的黏度影响液膜的表面张力，进而影响液体中气泡合并的难易度。液体中气泡液膜的表面张力加剧气泡的合并倾向。随着生物反应的进行，反应液中细胞分泌物增加，黏度变大，小气泡合并成大气泡，出现起沫现象。加入消泡剂，可以降低液膜的表面张力，阻止气泡的合并。,1.生物反应器,2.分类,（1）按反应器内有机体种类,（2）按结构特征,生物反应器在生物制药过程中的作用,（二）生物反应器的操作类型,1.简单分批培养,培养液一次性全部加入，接种培养一段时间后，将培养液一次性全部放出,2.补料分批培养,开始培养时，培养液没有一次性加足，在培养一定时间后，根据培养液营养成分的消耗情

3、况将部分营养成分连续加入反应器内（称之为补料），培养结束后一次性全部放出。,3.反复分批培养,在简单分批培养即将结束时，放出大部分的培养液，余下少量作为种子液，补充新鲜培养液后再重新培养，如此反复直至培养不能再延续时，再将发酵液全部放出。,4.反复补料分批培养,又称为半连续发酵，指在补料分批培养中进行一段时间、反应器内培养液体积达到最大无法再继续补料时，将培养液放出一部分，再继续补料，隔一段时间后再放出同样体积，如此反复操作，直到最后将培养液一次性全部放出。,第二节 培养基预处理设备,一、培养基灭菌设备,（一）蒸汽灭菌原理,蒸汽能深入到液体内部，并迅速穿透细胞壁，使细胞整体升温，致使细胞内蛋白质凝固失去生物活性，从而终止了细胞的新陈代谢过程。,高压蒸汽灭菌锅由内锅、外锅、门盖、压力表、温度计、排气阀、安全阀、电热管、蒸汽发生器等部件构成。,2.高压蒸汽灭菌锅的操作与维护,（1）使用前应清洗干净，进气阀及排气阀有效，加注水。 （2）装入灭菌物品：间隔合适，扣上门盖，旋紧密封。 （3）预热及排气：加热升温，排除冷空气，当排气阀有蒸汽排出时，关闭排气阀。 （4）升压保温：待蒸汽压力升至额定值

4、时，调节热源，或者微开排气阀，使锅内蒸汽压力恒定在额定值。维持规定时间后，停止加热。 （5）取出灭菌物品：缓慢排气，待其压力下降至零时，方可打开取物。,（2）喷射器结构,蒸汽和培养液在喷射器的吸入室中混合均匀，在喉管和扩大段进一步混合均匀后排出。,灭菌后的培养基经过膨胀阀进入真空冷却器瞬间冷却,喷射加热连续灭菌流程是目前常用的培养基灭菌方法，其特点是加热、冷却过程极为短暂，所以将温度升高到140 而不引起培养液的严重破坏。因维持设备是管道，如果设计合理，则返混程度很小，可保证物料的先进先出，避免了培养基在灭菌过程中局部过热或灭菌不充分的现象发生。,糊化阶段，淀粉水解转化成糊精； 在糖化阶段，糊精被淀粉糖化酶转化成单糖或二糖 。,（一）糊化锅,糊化锅用来加热煮沸淀粉原料使其液化和糊化的设备。,糊化锅的关键部件有锅盖、锅体、夹套和搅拌器等。,（二）糖化锅,糖化锅是糊精水解成单糖或二糖的反应容器，其结构与糊化锅基本相同，单体积更大，约为糊化锅体积的两倍。,将糊化后的浆状料液输送到糖化锅中，加水稀释混合，并加入糖化酶，将温度保持在一定的范围内，经一段时间后料浆即可糖化完毕。,三、双酶制糖工艺,

5、淀粉液化酶 作用于淀粉-1,4葡萄糖苷键，将长链的淀粉水解成短链糊精，使淀粉液化，产物以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。,糖化酶 可作用于-1,4或 -1,6葡萄糖苷键，可将糊 精完全水解为葡萄糖或 麦芽糖，即淀粉的糖化。,双酶制糖工序有调浆、液化、糖化和过滤。生产设备主要有糊化锅、糖化喷射器、维持罐、冷却装置等。,（3）两类搅拌器的搅拌效果,耙式消泡器 涡轮消泡器,6.换热器,换热器有夹套式和竖管式两种。小型罐采用夹套式，以减少罐内的结构，但传热效果差。大型罐中，常采用竖管式，分组对称安装在罐内壁上。依据竖管的排列结构，可分为蛇管和列管等形式。,二、气升式发酵罐,气升式发酵罐由罐体、导流筒、循环管、空气喷嘴等部件组成。在气升式发酵罐中没有机械搅拌器及相关装置，采用高速气流和密度差带动发酵液流动、混合。,有环流式、鼓泡式、空气喷射式等气升发酵罐。,按发酵液流动方式，环流式发酵罐又可分为内循环和外循环两种。内循环方式中，又有中央导流筒式和双带导流式。,1.气升式发酵罐结构,洁净空气以250 300m/s，的速度从喷嘴喷出，并以气泡的形式分散于液体中。含大量气泡的发酵液沿循环管上升。在上

6、升过程中，气泡中的氧气溶解于发酵液内，过量的气泡在罐的顶部释放出来，发酵液气含率下降，形成富含溶氧和较少气泡的液体。由于发酵罐上部液体气泡少密度大，下部液体气泡多密度小，在密度差和重力作用下，上部液体沿循环管下降，下部液体上升，形成发酵液在发酵罐内的循环流动，空气喷嘴高速喷出的空气也推动发酵液沿循环管流动。,气升式发酵罐的优点是结构简单、能耗低、液体中的剪切作用小。在同样的能耗下，氧的传递能力比机械搅拌式发酵罐要高得多。气升式发酵罐不适用于黏度高或固含量大的发酵液。,搅拌器的关键部件是吸气转子，吸气转子由三棱空心叶轮与固定导轮组成，搅拌轴为中空，与进气管相连，在电动机的驱动下，轴上的空心叶轮快速旋转，液体被甩出，在叶轮中心形成负压，将罐外的无菌空气吸到罐内。随着叶轮的转动，吸入的气体在叶轮周围分散成细碎的气泡，形成了强烈的气液湍流，气泡中的氧气随之扩散到发酵液中，在搅拌的同时完成了氧气的溶解过程。,自吸式发酵罐的结构和工作原理,泡塔式发酵罐的高径比约为7左右，罐内安装有筛板和空气分布器，降液管具有液封的作用。,压缩空气由罐底导入，经空气分布器后，穿过筛板气孔，逐板上升。发酵液充满塔体。

7、在空气泡上升的过程中，密度小的含气发酵液也随之上升，上升后的发酵液释放空气泡，密度增大，在密度差和重力作用下又沿降液管下降，从而形成循环。空气泡的上升和发酵液的循环流动，产生气液混合效果，促进了氧气的溶解。,鼓泡式发酵罐省去了机械搅拌装置，造价低，又不会产生液封导致的染菌问题，因而使用范围较广。如果培养液浓度适宜，操作得当，在不增加空气流量的情况下，基本上可达到通用发酵罐的发酵水平。,第四节 发酵罐信号控制系统,生物反应是一个动态的过程，随着反应的进行，营养成分、新的细胞以及代谢过程产物等因素都在改变。必须对反应过程进行监控，适时调节各参数。,需要监控的内容:,物理参数，包括温度、压力、搅拌速度等； 化学参数，包括液相pH、氧气和二氧化碳的浓度； 生化参数，生物体量、生物体营养和代谢产物浓度等。,2.发酵液中pH的调控,发酵罐pH的控制是依靠向罐内滴加酸或者碱来完成。,pH电极感知酸碱性，以电信号传递到放大控制仪，启动并控制酸、碱泵动作，向罐内滴加酸、碱液，实时调节发酵液pH值。,二、发酵罐的检测仪器,条件：,原电池电极在测量之前无需预热就可对溶液中的溶解氧浓度改变作出快速响应，系统只

8、需4050秒就可以达到实际读数的95。,极谱溶氧电极采用金、铂等金属和Ag/AgCl 构成 的电解池系统，需要在电极两端加上一恒定的极化电 压。当氧分子渗透过隔膜后，在阴极被还原，从阳 极到阴极的电流与电解液中溶解氧的浓度成正比。,（一）贴壁培养设备,有培养瓶和膜反应器两种形式,1.培养瓶,滚瓶及培养架,2.膜反应器,中空纤维膜是半透性多孔膜，氧气与二氧化碳等小分子可以自由地穿过膜进行双向扩散，细胞和其他大分子有机物则不能通过。将成束的中空纤维管以列管方式密封在一矩形容器中，再从容器的两端分别安装管程和壳程流体的进出口，即可制成培养细胞的膜反应器。,中空纤维膜反应器,实验室中空纤维膜细胞培养反应器,中空纤维膜,细胞培养器模型,（二）悬浮培养设备,笼式通气搅拌反应器,笼式通气搅拌反应器内有一个电磁驱动的圆筒状旋转搅拌笼，搅拌笼由中空的搅拌内筒、内筒顶端3个中空的吸管搅拌桨叶、和内筒外侧由不锈钢丝网构成网状笼壁组成的环状区。吸管搅拌桨叶在旋转中使内筒顶部形成负压，将反应液从内筒底部吸入。,（三）微载体培养设备,在搅拌式通气发酵罐、气升式通气发酵罐、中空纤维培养装置、多级流化床和固定床等反应

9、器中，放入不锈钢、玻璃、光面陶瓷、塑料等材料做成多孔载体，即构成细胞悬浮培养反应器。,多孔载体对动物细胞有很好的亲和性，可使动物细胞贴附在载体上。贴附了细胞的多孔载体悬浮在培养液中，细胞吸收营养成分不断生长。这种培养方式结合了贴壁与悬浮两种培养方法特点，适合于大规模动物细胞培养。,二、植物细胞培养设备,植物细胞有细胞壁，其抗剪切性能高于动物细胞，无贴壁生长特性，与微生物培养过程相似。植物细胞的培养设备主要有机械搅拌式、鼓泡塔式、气升式、转鼓式和固定化式生物反应器。,（一）机械搅拌式设备,将各式发酵罐的搅拌器和通气系统改造后，即可用来进行植物细胞培养。,常见植物细胞培养反应器搅拌叶片,（二）气升式设备,目前在各式植物细胞培养过程中，使用得较多的是气升式发酵罐，其结构已介绍过。,气升式发酵罐结构简明，没有泄露点和死角，既有较好地防止杂菌污染性能，又能在低剪切力下达到较好的混合与较高的氧传递效果，且操作费用较低，但进行高密度培养时混合不够均匀。,（三）鼓泡塔式设备,鼓泡塔式生物反应器依靠喷嘴及多孔板实现气体渗透扩散作用，可以在很低的气速下培养植物细胞（详见第三节）。由于没有运动部件，操作不易染菌，同时在无机械能输入情况下，提高了较高的热量和质量传递，因而适用于对剪切力敏感的细胞培养，放大相对容易。其缺点是，流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏有关反应器的参考数据。,（四）转鼓式设备,转鼓式生物反应器是通过转动促进反应器内氧及营养物的混合，通过设置挡板提高氧的传递，在高密度培养时有高的传氧能力。对于高密度培养，转鼓式优于搅拌式。如在紫草的细胞培养中，转鼓式优于气升式和改良搅拌式生物反应器。其缺点是，难于大规模生产，放大困难。,本章学习内容总结,

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