Immunhisprotocol
39页1、.一、 免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫细胞化学。(一)对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。-对抗体的要求:纯度高、比活性强;*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。-对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。(二)抗原(antigen,Ag)*抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:-免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性;-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。*根据抗原是否显示免疫原性分为:完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。(免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性)半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某
2、些短肽、多糖、类脂和药物等。(半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性)。载体通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。(三)抗体(antibody,Ab)1、抗体的概念:*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。-抗体主要存在于血清内;抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。*多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血
3、中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低,会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于:所需抗血清的量:小鼠只能提供1.01.5ml的血液,而山羊能提供几升。能供免疫用的抗原量:小鼠50&61549;g足够,而山羊需要几毫克。动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。(2)佐剂(adjuvant)*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中,常将抗原和佐剂一起注射。*最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadju
4、vant);弗氏完全佐剂(Freundscompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadjuvant,FIA)是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或5:1,可根据需要而定,通常2:1。(使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂)弗氏完全佐剂(Freundscompleteadjuvant,FCA)是在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml),即成为FCA。*免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。一.佐剂与抗原乳化的方法:*研磨法(适于制备大量的佐剂抗原):先将不完全佐剂加热,取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,
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