3D多细胞肿瘤球的培养
6页1、3D多细胞肿瘤球的培养3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚 体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比,3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网 络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用,从而更加贴近肿瘤组织中相应的 病理生理特征。因此,3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、 药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性,但是与2D贴壁细 胞培养模型相比,获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养 过程和表征手段。本文利用Liquid Overlay的制备方法,以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模 型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜 对其进行详细表征。1实验前准备工作1. 提前24 h取12mLDMEM和RPMI 1640完全培养基(含10%FBS,下同)于50 mL 离心管内,置于4C冰箱中预冷;2. 将分装好的Ma trigel基质胶提前24 h从-20C放入4C,使其融化成液体状 态;3. 将无菌
2、的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内,置-20C冰箱预冷。琼脂糖包被96孔板1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基(或DMEM培养基)于2个10 mL的注射玻 璃瓶内,加入90 mg琼脂糖,盖塞后放入80C的水浴锅内加热溶解30 min;2. 加热结束后,将注射瓶放入灭菌锅内,115C灭菌30 min;3. 灭菌完成后,迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入 无菌的加样槽中,用多通道移液器以每孔60 L的量加入96孔板内。注意:由于琼脂糖溶液在室温时会凝固,因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。此外,为保证加样时琼脂糖不冷却,需要同时灭菌加样槽和100 口 L的移液器枪 头。4. 加入完成后,96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。3配置含Matrigel基质胶细胞悬液1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞(或MCF-7细胞),胰蛋白酶消化后进行细 胞计数,用RPMI 1640完全培养基(或DMEM完全培养基)将细胞悬液浓度调整 至 2.0X105 cells/mL,备用。2. 将盛满碎冰的烧
3、杯喷完酒精后放入超净台内,将RPMI 1640完全培养基以及 解冻的Ma trigel基质胶从冰箱内取出置于冰上。注意:由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固,因此在操作过程中一定要保持 低温。3. 将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计算量(2.5%, v/v)用移液 器将300 口 L Matrigel基质胶加入到12 mL RPMI 1640完全培养基内,迅速混 匀。注意:由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固,因此使用的移液器枪头也需要 预冷。4. 加入步骤1中的细胞悬液(约600 口L),使细胞浓度为10000 cells/mL, 迅速混匀,备用;4将细胞悬液铺入琼脂糖包被的96孔板1. 将上述步骤4中配置好的含有Matrigel基质胶的细胞悬液放入加样槽内,用 多通道移液器吸取200 口 L加入到包被琼脂糖的96孔板内。2. 采用低温离心机进行离心,离心条件为4C,1000Xg,10 min。注意:离心96孔板时为保持无菌,将96孔板的周围用封口膜封住。-LJJ3. 离心完成后,取出 96孔板,摘下封口膜,喷洒酒精后放入培养箱内培养。整 个培养流程如图1 所示。4. 在培养的第3、5和7天,更换孔内的100 uL培养基并采用倒置显微镜观察 肿瘤球的形态。5若要采用3D多细胞肿瘤球进行药物试验,在培养7天后,用移液器取出孔内 的100 口 L培养基,加入100 口 L给药溶液,然后置于培养箱内培养并定期采用 倒置显微镜观察肿瘤球的生长状况(图 2)。3D 多细胞肿瘤球的表征1. 倒置显微镜观察 3D 多细胞肿瘤球形态:直接将 96孔板置于倒置显微镜下观 察即可。2. 激光共聚焦显微镜观察:用移液器小心取出孔内的肿瘤球,用 PBS 清洗3 遍 后,采用4%多聚甲醛固定,并用Hoechst 33258对细胞核进行染色,PBS清洗3 遍后在激光共聚焦显微镜下观察(图 3)。3环境扫描电镜观察:用移液器小心取出孔内的肿瘤球,用PBS清洗3遍后,固 定干燥后进行环境扫描电镜观察(图 4)。1呃會IEMag HV W户晒第卿曲晰強3:2a*&iAWSOTi7.0 kVeiimmi ffl.D PP Low Mtuuiil
《3D多细胞肿瘤球的培养》由会员ni****g分享,可在线阅读,更多相关《3D多细胞肿瘤球的培养》请在金锄头文库上搜索。
安全管理新思维:人与组织安全绩效 (HOP)简介
小学语文一年级教案-《大熊猫》教学设计之一
甘肃省成县苇子沟学校2011届九年级数学期中考试
我是一条流浪狗
2023稻草人的读后感合集15篇
寒假线上辅导工作方案
2023安检大队工作总结模板(2篇).doc
2021年小班美术绘画绕团教案
倔强架子鼓演奏教学教学视频 倔强架子鼓鼓谱
黑龙江省龙东地区五市2013年中考数学试卷(解析版)
智能别墅解决方案
2023年幼儿园学期工作述职报告范文三篇
毕业设计(论文).net企业人事工资管理系统
Minitab帮助基础知识
第一册读本文言文语段翻译
东北大学21春《现代机械设计理论与方法》在线作业三满分答案75
实习证明模板(13篇)
学校艺体活动方案
四川省广元市川师大万达中学高二物理3月月考试题无答案
光纤熔接机使用方法
2023-03-28 4页
2022-07-30 8页
2023-01-02 3页
2024-02-23 3页
2023-02-05 2页
2023-04-14 9页
2022-12-29 4页
2023-05-06 1页
2024-01-10 25页
2023-11-10 26页