WB实战指南+正确使用Quantity One定量

1、来 dxy 好多年了，这些年陆陆续续回复了一些帖子，可是回来回去，发现大家提的问题，还是 那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结经验的帖子，不知道该如何评 价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，新手参考这些当然难获进益。实在受不了， 这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成 WB 实战指南，欢迎行 家批评指正。首先，摆摆自己的经验。鄙人做 WB 有 8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛， 凑数的单篇有上24+, 一作单篇15+ （系国内完成；注：当年的IF,现在逐年递减没个标准）。 其次，由于一些机缘的因素，在实验室WB体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了 一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求；如何缩短 操作时间，使实验进行的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍采用的却可以看 成浪费时间的操作，Bradford法蛋白定量和立春红染膜做专门批判，这在以前的WB操作指南是 绝无的，甚至叛离被视为经典的

2、分子克隆。 可是，请记住，经典是人定的。话不多废，开始：样品制备：变性条件一一SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘， LB 久 煮某些性质会改变）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔 板细胞80%以上密度，需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的（因 此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后 会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1.再煮 5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min； 2.如果10min煮样后，仍然吸不起来， 才适当增加SDS LB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以 失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层） 此方法的缺点，SDS LB煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的 样品有使用局限。非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实

3、类似） 裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是： 20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCI2, 0.5% NP- 40 and protease in hibitors （20pg/ml leupepti n, 10pg/ml pepstatin A and 10 pg/ml aprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实 用 0.5mM PMSF 替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加 1mM Na3VO4 （现加现用）， 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试 验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M （生理盐浓度）、0.3M、0.6M （高盐系 列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及 0.8-1.2M； 0.3M 及以下适合 IP 试验， 0.6M 及以上适合纯化蛋白，尤

4、其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组 成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%,但此时染色体会析 出，沉淀粘稠。组织块裂解： 组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。 当组织超微量的时候，比如 50mg 新鲜癌组织，我采用的方法是1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎； 反复多次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。 理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件； 但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA （牛血清白蛋白）之类的蛋白质， 除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46 kDa之间的时候；用任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋 白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附任意抗

5、体，从而最终被识别。同理，采用 SDS LB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。 采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如 AKT 等），还会出现的问题是：1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA 沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心 过程，离心管的摆放非常讲究，要 180度翻转离心两次。bo重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件， 相对麻烦。实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的 WB实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦一一经验之谈，我曾经参与的 cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是cell lysis；偶尔用到上清，也 只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。样品制备完，应立即低温保存（-20 度短期（几天）；

6、-80 度长期；例外， IP 用样品应直接进行 IP,避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）SDS LB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS 沉淀；SDS 4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDS LB 不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题； WB 本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即 使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂 解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我 将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10% 最底边约 25KDa， 12%最底部约 12KDao 8%胶可以跑 300KDa-36KDa 之间的任意蛋白，转膜 效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的

7、影响都问题 不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA （应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适 合gibco model V16型，胶宽20cm）。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增 大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。散热 不好，条带出现波浪状。注意事项：1聚丙烯酰胺的 30%母液会降解，要 4度避光保存。2. APS会失效，10%APS 般保质期才一个月左右。-20度分装长期保存。3注意Tris buff的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋 白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖 尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）4上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置 处于短路状态，液体会过热。 SDS-PAGE 胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细 微的凹陷

8、处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不 均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会 导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏 处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力， 拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）； 严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳 子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好 用。6上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶 和玻板，样品会泄露。7.未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品（含5ul 4*SDS LB ），可用8-8.5ul 4*SDS LB平衡。同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。LB若在室

9、温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变 形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。&增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所 有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幕 量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并 去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样 WB 条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul （最少80ul，这样 面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度 条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已 经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没 有的仍然没有），且条带都很丑。9.不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样 品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul 4*SDS LB达到常规20ul上样体积；后者第8点提到 只上5ul，同样+5ul SDS LB （比重同，不会互相挤压），最好补加10ul DDW使总体积一致。通 常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入 8-8.5ul4*SDS LB）,这样才能确保每条带都很美观。10. SDS PAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙）， 用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期 4 度保存。个人习惯为，灌好分离胶用饱和的 正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较 大，可以提前灌好 SDS PAGE。样品是否一定需要定量再上样？不是的，这是浪费时间的一个操作。 我们首先来讨论一下蛋白定

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