临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证

WS/T 8072022 1 临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证 1 范围 本标准规定了临床微生物形态学检查、培养、鉴定、药敏、分子即时检测等系统性能验证的要求。本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 442 临床实验室生物安全指南 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 WS/T 640 临床微生物学检验标本的采集和转运 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 参考方法 reference method 一种无系统误差，随机误差可控，且准确清晰地描述了测定一个或多个性能参数的检测方法，可用于评估其他检测方法的性能。3.2 比对方法 comparator method 用于评估新系统的方法，包括参考方法或已获得药监局批准的商品化方法。3.3 接种物浓度 inoculum 接种于微生物检测系统的菌悬液中微生物的浓度，以每毫升菌落形成单位（colony-forming units per milliliter，CFU/mL）表示。3.4 标准菌株 reference strain 由菌种保藏机构保藏，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。3.5 性能验证 verification 通过提供客观证据，确认微生物检测系统在用于患者标本及标本分离株检测之前能达到与制造商说明书一致的性能。3.6 能力验证 proficiency testing；PT 利用实验室室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力（ISO/IEC 17043,3.7）。注：能力验证活动包括获认可的能力验证提供者的能力验证计划，以及卫生系统权威机构提供的比对（实验室间质量评价）。3.7 准确度 accuracy 测量值和真实值之间的一致性接近程度。本标准用以描述准确鉴定同一待测菌的能力或准确确定同一待测微生物/抗微生物药物组合敏感性结果的能力。3.8 精密度 precision WS/T 8072022 2 在规定条件下，对同一或相似被测对象重复测量得到的测量示值或测得量值的一致程度。3.8.1 可重复性 repeatability 在一组测量条件下，包括相同检测程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点，短时间内对同一或相似被测对象重复测量的精密度。3.8.2 再现性 reproducibility 在包括了不同的地点、不同的操作者、不同的测量系统的测量条件下对同一或相似被测对象重复测量的精密度。3.9 符合率 agreement rate 采用不同方法对同一待测物定性检测结果的一致程度，也称一致率。3.10 定量限 limit of quantitative；LOQ 在规定的实验条件下，样品中待测组分能以规定的准确度（作为总误差或作为偏差和精密度的特定要求）被定量测定的最低量值。3.11 检出限 limit of detection；LOD 指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。3.12 最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration；MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中，能抑制肉眼可见的微生物生长的最低药物浓度。3.13 分类一致性 category agreement；CA 被评估的药敏方法与参考方法或比对方法相比，判断结果为敏感、中介、剂量依赖性敏感和耐药的一致性。3.14 基本一致性 essential agreement；EA 待测系统MIC值与参考方法或比对方法MIC值相差不超过1个对倍稀释度（细菌）或2个对倍稀释度（酵母菌）。待评估方法为纸片扩散法时，不计算EA。3.15 极重大偏差 very major discrepancy；VMD 待评估的药敏系统检测为敏感，而现有商品化检测系统检测为耐药，即假敏感。3.16 极重大误差 very major error；VME 待评估的药敏系统检测为敏感，而参考方法检测为耐药，即假敏感。3.17 重大偏差 major discrepancy；MD 待评估的药敏系统检测结果为耐药，而现有商品化检测系统检测为敏感，即假耐药。3.18 重大误差 major error；ME 待评估的药敏系统检测结果为耐药，而参考方法检测为敏感，即假耐药。3.19 小偏差 minor discrepancy；MD 待评估的药敏系统将现有商品化检测系统的中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介。3.20 小误差 minor error；ME 待评估的药敏系统将参考方法的中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介。WS/T 8072022 3 3.21 专家系统 expert system 提示非典型或异常药敏结果的抗微生物药物敏感性的分析软件。3.22 即时检测 point-of-care testing；POCT 亦称近患检验（Near-patient testing），在患者附近或其所在地进行的、其结果可能导致患者的处置发生改变的检验。3.23 临界值 cut-off value 作为判断特定疾病、状态或被测量存在或不存在的界限的数值或量值。3.24 正确度 trueness 多次重复检测所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度。通常用“偏倚”表达，是对系统误差的衡量。4 风险评估 4.1 风险评估是评估危害发生的概率和危害严重程度。风险评估应考虑到错误结果、结果延迟、结果缺失或治疗延误的风险。4.2 错误检测结果带来的风险 新检测系统未执行全面验证方案或现有系统部分改变时未执行部分验证方案，可能造成鉴定错误、药敏检测错误等，从而给患者带来一定风险，详见表1。错误结果带来的风险因致病菌种类或菌种/药物组合而异，如漏检苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（假敏感）所带来的风险较将大肠埃希菌氨苄西林报告为假耐药更为严重。当错误结果带来的风险较高时，实验室应增加附加检测试验。表1 微生物检测系统错误结果所带来的风险 项目项目 错误检测错误检测 风险风险 形态学检查形态学检查 将革兰阴性菌报告为革兰阳性菌 将革兰阳性菌报告为革兰阴性菌 致临床选用抗菌药物错误 未检测到标本中的可疑致病菌 漏检，延误患者治疗时机，严重者可引发传播风险，如结核分枝杆菌 分离培养分离培养 培养基、血培养或培养条件不能检出可能致病菌 漏检，延误患者治疗 接种物浓度不足或过量 定量培养判读错误 细菌鉴定细菌鉴定 将定植菌、非致病菌报告为致病菌 1.干扰医生诊断 2.不必要的抗菌药物治疗 仪器错误鉴定细菌 引向错误治疗方向 质谱仪器：1.数据库未覆盖待测菌 2.自建数据库错误鉴定待测菌 1.菌种鉴定错误 2.引向错误治疗方向 3.出现防控漏洞 沙门菌属/志贺菌属血清学检测：1.不能检出沙门菌属/志贺菌属 2.不能准确分型 1.漏检，延误传染病防治时机 2.错误发放分型结果 药敏检测药敏检测 仪器错误报告MIC或S/I/SDD/R注 产生VME、ME 误导临床选用抗菌药物 没有折点的细菌报告S/I/SDD/R 误导临床选用抗菌药物及剂量 天然耐药的药物常规检测，且检测结果为敏感 误导医生选错抗菌药物 体外测试敏感，体内无效的药物 误导医生选错治疗方案 感染免疫学定性感染免疫学定性/定量检测定量检测 未检测到标本中的可能致病菌 漏检 延误治疗时机 方法学干扰因素等阴性标本检出结果为阳性 引向错误治疗方向 分子分子P POCTOCT检测检测 检出限未达标不能检出可疑致病微生物或耐药基因 漏检致病菌或耐药菌 延迟临床选用药物及延误治疗时机 WS/T 8072022 4 表 1 微生物检测系统错误结果所带来的风险（续）项目项目 错误检测错误检测 风险风险 阴性标本检出结果为阳性 引向错误感染病防治方向 注：S，susceptible，敏感；I，Intermediate，中介；SDD，susceptible-dose dependent，剂量依赖性敏感；R，resistant，耐药。4.3 验证样品量、样品类型带来的风险 验证样品量或验证类型不足带来的风险包括：a)分离培养系统标本多样性不足，不能准确判断相应标本各类目标菌种的分离概率。b)培养、鉴定系统入选菌种或标本多样性不足，不能鉴定同一属细菌亲缘关系近的菌种；对于少见菌、不常见菌可能造成漏检或错误鉴定。c)验证药敏检测系统时，不覆盖耐药或中介的菌株或折点附近的菌株，可能产生较高的 VME、ME。d)选用的菌株均是低 MIC 或高 MIC 值的菌株，易造成系统验证结果偏差。5 性能验证相关通用要求 5.1 性能验证应在以下情况下执行，具体不同的检验项目见本标准各章条内容。性能验证应在以下情况下执行：a)检验程序常规应用之前。b)任何严重影响检验程序分析性能的情况发生后，应在检验程序重新启用前对受影响的性能进行验证。5.2 验证后的质量保证 常规使用期间，为能满足检验结果的预期用途，可基于检验程序的稳定性，利用日常工作产生的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能进行评估。包括但不限于如下：a)持续的质量控制（quality control，QC）。b)能力验证（PT）/室间质评不适用时，采用替代方法，应至少每半年评估一次准确度。c)人员的培训和能力测试：定期评估人员的检测能力，如培训新出现的耐药表型、分类学变化和折点的更新等。d)仪器和软件维护：检测到仪器和软件的问题应采取相应措施，并跟踪评价纠正措施。e)按照制造商使用说明书要求进行年度评估。f)异常结果的再审核：如药敏专家系统鉴定的异常结果应进行其他确认试验。确认后的异常结果（如新的耐药表型）应及时上报负责人。6 细菌、真菌形态学检查的性能验证 6.1 染色方法的性能验证 6.1.1 验证时机 实验室使用新的染色方法前、更换厂家或品牌后应进行性能验证。6.1.2 验证菌株 实验室常用的细菌、真菌形态学显微镜检查项目有：革兰染色、抗酸染色(萋尼法、荧光法)、弱抗酸染色、墨汁染色、真菌钙荧光白染色、乳酸酚棉蓝染色和六胺银染色等。标准菌株、QC菌株或经过明确鉴定（如质谱或DNA序列分析确定）的临床菌株均可用于染色方法的性能验证。常用染色方法性能验证所使用的菌种及性能特点见表2。每项染色应至少选择5株菌，包括不同染色性能和形态特征的菌株。WS/T 8072022 5 表2 常用染色方法性能验证所使用的菌种及性能特点 染色方法染色方法 验证用菌株验证用菌株 性能特点性能特点或结果解释或结果解释 革兰染色 金黄色葡萄球菌 革兰染色阳性，呈紫蓝色 大肠埃希菌 革兰染色阴性，呈粉红色 抗酸染色（萋尼法、荧光法）分枝杆菌属（快生长分枝杆菌或灭活后的结核分枝杆菌）萋尼法抗酸染色阳性，呈红色 荧光法抗酸染色阳性，呈亮黄色 大肠埃希菌 萋尼法抗酸染色阴性，呈蓝色 荧光法抗酸染色阴性，无颜色 弱抗酸染色 诺卡菌属 弱抗酸染色阳性，呈红色 大肠埃希菌 弱抗酸染色阴性，呈蓝色 墨汁染色 新型隐球菌（脑心浸液培养物）黑色背景下可见酵母样孢子周围有明亮的荚膜 白念珠菌 黑色背景下未见明亮的荚膜 真菌钙荧光白染色 白念珠菌 真菌的菌丝及孢子均呈亮蓝色，结构清晰明显 大肠埃希菌 呈弱蓝色荧光 乳酸酚棉蓝染色 丝状真菌（如曲霉菌属）真菌染成蓝色，孢子及菌丝结构清晰 六胺银染色 肺孢子菌六胺银染色既往阳性标本或白念珠菌 肺孢子菌，包囊壁应呈棕黑色，圆形或椭圆形 真菌孢子和菌丝染成棕黑色 6.1.3 验证前准备工作 菌株要求：验证用细菌、真菌或分枝杆菌等应在相应培养基上复苏、传代后，使用新鲜（对数生长期）的纯菌落。人员要求：所有从事涂片染色镜检的工作人员均需接受各种染色方法标准操作的培训，且需进行辨色力检查。6.1.4 验证方案 6.1.4.1 验证过程 由本岗位人员进行菌株传代、菌落涂片、染色和镜检，填写性能验证记录表