倪培华-分子诊断技术基本原理及常见方法 上海交通大学医学院检验系
分子诊断技术基本原理及常见方法上海交通大学医学院检验系倪培华分子诊断策略一般性检出策略提供是否存在某种病原体感染完整性检出策略分型耐药性常用的分子生物检测方法基因扩增基因芯片技术核酸杂交限制性内切酶酶谱分析限制性片段长度多态性分析.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)PCR反应的特点对标本的纯度要求低特异性强灵敏度高 简便、快速整个PCR操指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平作过程，从标本处理、PCR扩增到产物分析，可在4h内完成全部实验引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制的步骤变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本组成其他DNA聚合模板酶引物脱氧核糖核苷酸DNA体内外复制30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles Copies of Target1 cycle=2 Amplicon122 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon244 cycle=16 Amplicon384165 cycle=32 Amplicon5326 cycle=64 Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247 cycle=128 AmpliconPCR扩增过程图示CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA100%EFFICIENCY 90%EFFICIENCY 80%EFFICIENCY 70%EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER 1 CYCLE45678326412825625478917032361319346111019835764314 100%=2.00 x244190%=1.90 x80%=1.80 x70%=1.70 x7011920234358399095121011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9901,1572,0823,7486,74716,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物逆转录生成cDNA方式 以oligo(dT)作为引物，mRNA3末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列(6 bp)混合物作为引物引物的在线设计工具及免费软件简介WWW GeneFisherhttp:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.htmlProject DOPE2http:/dope.interactiva.de/NetPrimerhttp:/ trachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CTGenbank中找到相应的基因序列www.ncbi.nlm.nih.gov采用引物设计软件进行引物的设计http:/frodo.wi.mit.edu/确保引物的特异性，将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/5AATGCAAATCGTTTCCTTGC35CGGAATTGTGCATTTACGTG3AATGCAAATCGTTTCCTTGCCGGAATTGTGCATTTACGTG 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)实时荧光定量PCR的特点灵敏度高特异性强可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单常用的荧光定量PCR方法SYBR Green ITaqman水解探针分子信标SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有与双链DNA结合后受到激发的时候，可以发出绿色荧光SYBR Green ISYBR Green I 工作原理灵敏度高,使用方便非特异性产物融解曲线TaqMan ProbesFAMTETJOE荧光素淬灭剂TAMRAHEX与目标序列互补TaqMan 探针的机理DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测TaqMan Probes工作原理荧荧光基光基团团淬淬灭剂灭剂游离的探游离的探针针光光能量能量转转移移另一波长的荧光Taq发发出出荧荧光光光光延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq分子信标(发夹型杂交探针)分子信标(发夹型杂交探针)Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号3.002.502.001.501.000.500.00与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比10 10 10432Threshold初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Cycle起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量定量PCR 随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)随机合成8-12 bp寡核苷酸(多为10 bp)作为引物 低退火温度PCR，使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合形成扩增产物 扩增循环次数一般为35-45 特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型 重复序列PCR（repetitive sequence-based PCR，Rep-PCR）利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为靶序列进行PCR 细菌菌株分型的重复序列有10多种 基因外重复回文序列（Rep）肠细菌基因组间共有重复序列（ERIC）在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的差异，而序列本身在进化过程中又具有高度保守 限制性片段长度多态性分析(restricted fragment length polymorphism，RFLP)限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA切割，进行凝胶电泳，依片段大小不同将其分离 不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，产生的DNA片断长度呈现多态性现象 传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern印迹杂交，应用该方法可以构建DNA指纹图1,marker(100 bp);2,PCR product of C.albicans;3,digestion of PCR productof C.albicans with MspI;4,digestion of PCR productof C.albicans with BlnI;5,PCR product of C.Dubliniensis(柏林念珠菌柏林念珠菌);6,digestion of PCR productof C.dubliniensis with MspI;7,digestion of PCR productof C.dubliniensis with BlnI;8,PCR product of C.glabrata(光滑念珠菌);9,digestion of PCR product of C.glabrata with MspI Southern Blot 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)大分子DNA在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶大分子通过凝胶的迁移率无差别，不能分离 在两个不同方向的电场周期性交替，依赖于分子大小，DNA 越大，时间越长，在凝胶中移动越慢，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离 DNA序列分析序列分析(DNA sequencing)ddTTPDNA序列分析序列分析DNA链中的戊糖在3位碳原子上有-OH基团，在 DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5-p与前一核苷酸的戊糖3-OH以磷酸二酯键相连双脱氧链终止法(Sanger)Sanger法是在反应体系中加入 2,3-ddNTP，由于其没有 3-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止 基因芯片技术（Gene Chip）谢谢
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分子诊断技术基本原理及常见方法上海交通大学医学院检验系倪培华分子诊断策略一般性检出策略提供是否存在某种病原体感染完整性检出策略分型耐药性常用的分子生物检测方法基因扩增基因芯片技术核酸杂交限制性内切酶酶谱分析限制性片段长度多态性分析.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)PCR反应的特点对标本的纯度要求低特异性强灵敏度高 简便、快速整个PCR操指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平作过程，从标本处理、PCR扩增到产物分析，可在4h内完成全部实验引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制的步骤变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本组成其他DNA聚合模板酶引物脱氧核糖核苷酸DNA体内外复制30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles Copies of Target1 cycle=2 Amplicon122 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon244 cycle=16 Amplicon384165 cycle=32 Amplicon5326 cycle=64 Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247 cycle=128 AmpliconPCR扩增过程图示CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA100%EFFICIENCY 90%EFFICIENCY 80%EFFICIENCY 70%EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER 1 CYCLE45678326412825625478917032361319346111019835764314 100%=2.00 x244190%=1.90 x80%=1.80 x70%=1.70 x7011920234358399095121011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9901,1572,0823,7486,74716,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物逆转录生成cDNA方式 以oligo(dT)作为引物，mRNA3末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列(6 bp)混合物作为引物引物的在线设计工具及免费软件简介WWW GeneFisherhttp:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.htmlProject DOPE2http:/dope.interactiva.de/NetPrimerhttp:/ trachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CTGenbank中找到相应的基因序列www.ncbi.nlm.nih.gov采用引物设计软件进行引物的设计http:/frodo.wi.mit.edu/确保引物的特异性，将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/5AATGCAAATCGTTTCCTTGC35CGGAATTGTGCATTTACGTG3AATGCAAATCGTTTCCTTGCCGGAATTGTGCATTTACGTG 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)实时荧光定量PCR的特点灵敏度高特异性强可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单常用的荧光定量PCR方法SYBR Green ITaqman水解探针分子信标SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有与双链DNA结合后受到激发的时候，可以发出绿色荧光SYBR Green ISYBR Green I 工作原理灵敏度高,使用方便非特异性产物融解曲线TaqMan ProbesFAMTETJOE荧光素淬灭剂TAMRAHEX与目标序列互补TaqMan 探针的机理DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测TaqMan Probes工作原理荧荧光基光基团团淬淬灭剂灭剂游离的探游离的探针针光光能量能量转转移移另一波长的荧光Taq发发出出荧荧光光光光延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq分子信标(发夹型杂交探针)分子信标(发夹型杂交探针)Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号3.002.502.001.501.000.500.00与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比10 10 10432Threshold初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Cycle起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量定量PCR 随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)随机合成8-12 bp寡核苷酸(多为10 bp)作为引物 低退火温度PCR，使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合形成扩增产物 扩增循环次数一般为35-45 特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型 重复序列PCR（repetitive sequence-based PCR，Rep-PCR）利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为靶序列进行PCR 细菌菌株分型的重复序列有10多种 基因外重复回文序列（Rep）肠细菌基因组间共有重复序列（ERIC）在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的差异，而序列本身在进化过程中又具有高度保守 限制性片段长度多态性分析(restricted fragment length polymorphism，RFLP)限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA切割，进行凝胶电泳，依片段大小不同将其分离 不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，产生的DNA片断长度呈现多态性现象 传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern印迹杂交，应用该方法可以构建DNA指纹图1,marker(100 bp);2,PCR product of C.albicans;3,digestion of PCR productof C.albicans with MspI;4,digestion of PCR productof C.albicans with BlnI;5,PCR product of C.Dubliniensis(柏林念珠菌柏林念珠菌);6,digestion of PCR productof C.dubliniensis with MspI;7,digestion of PCR productof C.dubliniensis with BlnI;8,PCR product of C.glabrata(光滑念珠菌);9,digestion of PCR product of C.glabrata with MspI Southern Blot 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)大分子DNA在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶大分子通过凝胶的迁移率无差别，不能分离 在两个不同方向的电场周期性交替，依赖于分子大小，DNA 越大，时间越长，在凝胶中移动越慢，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离 DNA序列分析序列分析(DNA sequencing)ddTTPDNA序列分析序列分析DNA链中的戊糖在3位碳原子上有-OH基团，在 DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5-p与前一核苷酸的戊糖3-OH以磷酸二酯键相连双脱氧链终止法(Sanger)Sanger法是在反应体系中加入 2,3-ddNTP，由于其没有 3-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止 基因芯片技术（Gene Chip）谢谢
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