感染性疾病(细菌类)分子检测及临床应用 李敏-仁济医院

感染性疾病感染性疾病(细细菌菌类类)分子分子检测检测及及临临床床应应用用李李 敏敏检验检验科科上海交通大学医学院附属仁上海交通大学医学院附属仁济济医院医院传统传统微生物微生物检验检验：病原体分离病原体分离鉴鉴定定(金金标标准）准）+药药物敏感性物敏感性试验试验24-48 hr24-48 hr24-48hr生化生化鉴鉴定定+药药敏敏试验试验3-5 daysPathogens causing human infectious diseases1%pathogens can becultured and identified inclinical labs;Many infectious diseaseshave no pathogen diagnosisresults2019/3/11Diagnosis of infectious diseases:urgent!脓脓毒症毒症发发生前，有效抗生素治生前，有效抗生素治疗疗每延每延迟迟1小小时时，平均生存率将，平均生存率将降低降低7.6%(3.6-9.9%);快速及快速及时时的病原学的病原学诊诊断断、有效合理抗感染治有效合理抗感染治疗疗对对挽救生命至挽救生命至关重要关重要.临临床感染性疾病床感染性疾病诊疗诊疗面面临临的的问题问题1：多重耐多重耐药药菌感染菌感染是是临临床抗感染治床抗感染治疗疗面面临临的棘手的棘手问题问题；2：非常非常规规病原体感染病原体感染诊疗诊疗能力有待提高（分枝杆菌，真菌，病毒，支原体，能力有待提高（分枝杆菌，真菌，病毒，支原体，衣原体，寄生虫等）衣原体，寄生虫等）2019/3/11微生物室：微生物室：迫切需要提高感染迫切需要提高感染诊诊断效率断效率生化生化鉴鉴定管定管生化生化鉴鉴定定仪仪器器鉴鉴定定免疫学技免疫学技术术（G实验实验、GM实验实验、隐隐球菌球菌荚荚膜多糖抗原、膜多糖抗原、艰难艰难梭菌毒素梭菌毒素检测检测，呼吸道病原体，呼吸道病原体9联检联检）生物活性物生物活性物质检测质检测（-干干扰扰素、素、CRP、SAA、PCT）核酸核酸检测检测技技术术(核酸核酸检测检测、耐、耐药药基因，分型，高通量病原体核基因，分型，高通量病原体核酸酸检测检测，NGS）快速快速诊诊断技断技术术MALDI-TOF MS（时间飞时间飞行行质谱质谱技技术术）病原病原诊诊断方法的断方法的发发展展诊诊断方法断方法显显微微镜镜病原病原鉴鉴定的定的时间时间数分数分钟钟，形，形态态学（淋球菌，学（淋球菌，隐隐球菌，分枝球菌，分枝杆菌）杆菌）革革兰兰染色染色数分数分钟钟，G+/G-培养和生化（培养和生化（细细菌，分枝杆菌，分枝杆菌，真菌）菌，真菌）数天数天-数周，耗数周，耗时时急性和恢复期抗体急性和恢复期抗体（EIA,ELISA)数周数周单单克隆抗体克隆抗体抗原抗原检测检测数小数小时时数分数分钟钟-数小数小时时（不能（不能进进行行药药敏敏检测检测）PCR检测检测病原体和耐病原体和耐药药基因基因 1-数小数小时时质谱质谱分析分析Mass数秒数秒-数分数分钟钟（细细落形成后）落形成后）spectrometry二代二代测测序序2-3天天2019/3/11新新兴兴前沿的前沿的 MALDI-TOF MS技技术术：微生物快速：微生物快速鉴鉴定革新技定革新技术术病原体病原体鉴鉴定革命性改定革命性改变变（2010-）:简简便、快速便、快速诊诊断人断人类类病原体病原体比常比常规规生化生化鉴鉴定定节节省至少省至少24小小时时证证明是一个可靠和快速的方法明是一个可靠和快速的方法%Int.1001713 mVsum=42832 mV Prof iles 1-25 Smooth Av 30436362898060407243539376479140638272715264948220073376604 729182069545362040004567567660008118 885310641122441200013258 1410880001000014000m/z5分分钟钟内得到内得到鉴鉴定定结结果果1-2天的分离培养天的分离培养进进一步加快准确一步加快准确诊诊断、有效合理抗生素治断、有效合理抗生素治疗疗的效率的效率数据数据库库更新：聚焦新出更新：聚焦新出现现的重要病原体的重要病原体人人类类感染中，感染中，马马耳他布耳他布鲁鲁菌占主要地位菌占主要地位;V3.2已覆盖已覆盖陆陆生布生布鲁鲁菌菌8种中的种中的6种，覆盖海洋种，覆盖海洋仅仅有的有的2种，以及近期种，以及近期报报道的乳房植入体分离的道的乳房植入体分离的1种种新新发发病原体：按蚊伊病原体：按蚊伊丽丽莎白金菌，耳道念珠菌莎白金菌，耳道念珠菌厌厌氧菌感染在氧菌感染在临临床上已床上已经变经变得越来越得越来越值值得关注；得关注；数据数据库库独有菌种：独有菌种：14种真菌，种真菌，7种霉菌，种霉菌，3种酵母菌，种酵母菌，11种支原体及种支原体及3种其他菌种种其他菌种血培养直接萃取血培养直接萃取鉴鉴定定血培养直接萃取血培养直接萃取鉴鉴定：定：血培养液抽取血培养液抽取6ml放入放入BD分离分离胶促凝管，离心后去除上清；胶促凝管，离心后去除上清；用用1ul一次性接种一次性接种环环挑取上述步挑取上述步骤骤得到的灰白色菌体富集物加入到得到的灰白色菌体富集物加入到500ul无菌水中无菌水中,13000rpm,离心离心2min;用无菌吸管吸取上清弃去，加入用无菌吸管吸取上清弃去，加入500ul无菌水无菌水悬悬浮并充分振浮并充分振荡荡混匀混匀，13000rpm,离心离心2min10-20分分钟钟质谱质谱萃取萃取鉴鉴定定结结果：果：马马尔尔尼菲尼菲蓝蓝状菌状菌MALDI-TOF MS技技术术在在临临床床实验实验室室应应用用领领域域核酸核酸检测检测技技术术在在临临床感染性疾病中的床感染性疾病中的应应用用 核酸核酸检测检测技技术术主要包括主要包括聚合聚合酶酶链链反反应应(PCR)、核酸探、核酸探针针杂杂交、基因芯片、交、基因芯片、测测序序等等 分子生物学分子生物学检验检验技技术术在感染性疾病中的在感染性疾病中的应应用主要包括用主要包括对对病病原生物原生物进进行行鉴鉴定、分型、耐定、分型、耐药药和治和治疗过疗过程中的程中的疗疗效效监测监测等等 应应用于用于不能或不易培养、生不能或不易培养、生长缓长缓慢的病原体慢的病原体引起的感染性引起的感染性疾病，如病毒性肝炎、艾滋病、流感、疾病，如病毒性肝炎、艾滋病、流感、结结核病、支原体、核病、支原体、衣原体等衣原体等2019/3/11结结核核 中国入榜中国入榜WHO的的“三高三高”负负担国家担国家.新新发发病例：病例：91.8万万.死亡病例：死亡病例：3.8万万.报报告病例：告病例：80.4万万“十三五十三五”要求要求:临临床床结结核防控工作重点核防控工作重点(到到2020年年).全国全国结结核核发发病率下降病率下降到到58/10万万.结结核病患者数核病患者数较较多和疫情偏高的地区，多和疫情偏高的地区，发发病率病率较较2015年下降年下降20%.肺肺结结核患者的病原学核患者的病原学诊诊断率达到断率达到50%以上（关口前移）以上（关口前移）.耐多耐多药药肺肺结结核核高危人群高危人群筛查筛查率达到率达到95%以上以上药药敏敏试验试验观观察察 孵孵育育4周周观观察生察生长长情况情况涂片涂片MTB培养培养孵育孵育4-8周周（阳性）（阳性）Sputum平均平均时间时间2-3个月个月液体培养及药敏试验平均时间20天涂片涂片（阳性）（阳性）分子分子诊诊断技断技术术只需2小时-2天涂阳涂阳=60-98%有有结结核分枝杆菌，核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学方因此涂阳后最好用分子生物学方法法进进行快速行快速鉴鉴定定结结核病分子核病分子诊诊断断RNA水平水平DNA水平水平蛋白蛋白质质水平水平IGRAs、TST等等恒温恒温扩扩增增鉴鉴定定变变温温扩扩增增扩扩增增杂杂交交T-SPOT.TB与QFT-GI为IGRAs实验SAT、TMA FISH、Probe鉴鉴定定+耐耐药药LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCR全血全血IFN-释释放分析技放分析技术术(IGRA)结结核感染者体内存在特异的效核感染者体内存在特异的效应应T淋巴淋巴细细胞，效胞，效应应T淋巴淋巴细细胞再次受到胞再次受到结结核抗原刺激核抗原刺激时时会分泌多种会分泌多种细细胞因子（胞因子（IFN-）。因此，）。因此，检测检测效效应应T淋巴淋巴细细胞可用于胞可用于结结核病或核病或结结核潜伏感染者的核潜伏感染者的诊诊断。断。由于效由于效应应T细细胞胞存活存活时间时间很短很短，而且，而且具有特异性具有特异性，因此可以作，因此可以作为为机体是机体是否正否正处处于被感染的指于被感染的指标标，无，无论论是否有是否有临临床症状。床症状。基于基于IGRA原理的原理的产产品目前已被品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷瑞士、法国、荷兰兰、日本、日本等二十余个国家写入本国的等二十余个国家写入本国的结结核核诊疗诊疗指南指南中结结果判断果判断图图空白空白对对照照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10阳性阳性对对照照（PHA）阴性阴性结结果果阳性阳性结结果果潜伏性潜伏性结结核（核（LTBI）诊诊断技断技术术比比较较难难以从感染者中以从感染者中鉴别鉴别出活出活动动性肺性肺结结核患者核患者IGRAs与与TST相比，具有更高的灵敏相比，具有更高的灵敏度和特异性度和特异性小于小于5岁岁儿童、免疫力低下患者不儿童、免疫力低下患者不适合采用适合采用IGRAs检测检测试剂试剂成本非常高成本非常高IGRAs与与BCG,NTM无交叉反无交叉反应应，TST有交叉反有交叉反应应核酸核酸扩扩增技增技术术核酸核酸扩扩增技增技术术反反应应条件条件热热循循环环扩扩增增产产物物检测检测方法方法实时实时RT-PCRDNADNART-LAMP恒温恒温GenoTypeMTBDRplus热热循循环环DNACPA恒温恒温恒温恒温DNARNANASBATMASAT恒温恒温恒温恒温RNARNA终终点点实时实时RNA作作为临为临床分子床分子诊诊断靶断靶标标RNA 拷贝数 DNA拷贝数生命力旺盛的病原体RNA转录活跃较好的愈后指标TMA、S AT优点交叉污染少SAT技技术术同一温度下（同一温度下（42），以），以RNA为为起始模板起始模板，通，通过过M-MLV反反转录转录酶酶产产生一生一个双个双链链DNA拷拷贝贝，然后利用，然后利用T7 RNA多聚多聚酶酶从从DNA拷拷贝贝上上产产生多个（生多个（1001000个）个）RNA拷拷贝贝；每一个；每一个RNA拷拷贝贝再从反再从反转录转录开始开始进进入下一个入下一个扩扩增循增循环环；同同时时，带带有有荧荧光光标记标记的的探探针针和和这这些些RNA拷拷贝贝特异特异结结合，合，产产生生荧荧光。光。该荧该荧光信光信号可由号可由荧荧光光检测仪检测仪器器实时实时捕捕获获，直，直观观反映反映扩扩增循增循环环情况情况RNA(+)Forward PrimerRTRNA(+)DNA(-)RNase H activityDNA(-)DNA(-)Reverse PrimerRTDNA(+)DNA(-)T7100-1000 copiesDNA(+)DNA(+)RNA(-)RNA(-)Forward PrimerMolecular BeaconRT/RNase H activityReverse PrimerRNA(-)MTBC-鉴鉴定定MTB复合群复合群(TMA技技术术)方法名称：方法名称：HPV（Hybridization Protection Assay）-杂杂交保交保护护分析法分析法原理：原理：以以rRNA为为靶靶标标，采用，采用线线性探性探针针技技术检测结术检测结核分枝杆菌复合群核分枝杆菌复合群HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct):2.5h 报报告，直接从告，直接从标标本中本中检测结检测结核菌核菌HPA-Accuprobe:1h 报报告