分子生物 第2章 聚合酶链反应 第4章 序列分析技术 第5章 基因突变技术(林小聪)

1、聚合酶链反应第二章P PolymeraseC ChainR Reaction*1授课：广东医科大学授课：广东医科大学 林小聪林小聪KaryKaryB.MullisB.Mullis（19441944）http:/ PCR(polymerasechainreaction)技术，是一种用1对引物在体外扩增基因片段的方法，由美国科学家KaryBMullis于1983年发明的。 一、PCR技术的发展历程及科学价值*2第一节第一节 PCR技术概述技术概述PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKaryB.MullisB.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）19711971年年, ,KhoranaKhorana等提出在体外等提出在体外DNADNA经变性经变性, ,与适当引与适当引物杂交后用物杂交后用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。19831983年年, ,MullisMullis发明了发明了PCRPCR技术。技术。19881988年年, ,SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq) )引入引入PCRPCR技术技术19

2、891989年年, ,美国美国ScienceScience杂志列杂志列PCRPCR为十余项重大科为十余项重大科学发明之首学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年。爆炸年。19931993年年, ,MullisMullis荣获度诺贝尔化学奖。荣获度诺贝尔化学奖。*3DNAPolymerasedNTPsPCRbuffer,Mg2+PrimersTemplateDNA5种基本组成成分*4二、PCR反应体系三、PCR技术的基本原理(1)DNA模板热变性(denature)：94左右高温使模板DNA完全变性。(2)单链DNA模板与引物退火(annealing)：55左右引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性。(3)引物的延伸(extension)：72左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。*55Primer15 Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技术的基本原理示意图Taq酶Taq酶*6Cycle35555555555555555DNA的扩增倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数。253

3、5次循环可扩增100万倍以上*7变性9395C左右延伸酶最适温度延伸时间退火引物Tm-5C*8思考题1四、PCR反应的基本步骤PCR反应循环琼脂糖凝胶电泳分离 PCR技术的主要特点(1)特异性强(2)灵敏度高(3)简便快速(4)对标本的纯度要求低*9五、PCR反应的主要特点和结果评价 衡量PCR好坏的参数：(1)特异性Specificity:最好只有目的DNA带。(3)真实性Fidelity:DNA序列正确。(2)产量Quantity:DNA带明亮。*10思考题2(4)敏感性Sensitivity：极限值为1个DNA模板。*11第二节第二节 PCRPCR的引物设计和反应条件优化的引物设计和反应条件优化*12 一、PCR引物的设计 用计算机软件进行设计，可通过每一引物设计变化的预定值选择，在扩增特异性和扩增效率两者间取得平衡，找出最佳引物。1.引物的位置引物对分别与拟扩增的DNA片段两端的序列互补，其中一个为正向引物(forward primer)，另一个为反向引物(reverseprimer)。 基因组DNA:选保守区,且与非扩增区无同源序列 cDNA:置mRNA编码区内,且尽可能在不

4、同外显子上*132.引物的长度3.引物末端 每条引物与模板DNA互补部分的长度可在1640mer范围内，以1824mer为最佳。 引物与模板DNA互补部分每增加1个核苷酸可使引物的特异性提高4倍。过短特异性降低；但过长则退火时引物与模板结合不充分。 引物3-端第1和2个碱基错错配会影响DNA聚合酶的延伸从而影响扩扩增的效率及特异性。尤其是A。 引物5-端碱基无严严格限制；长长度足够时够时 可不与模板DNA互补补，不互补补部分可加上内切酶位点等各种序列。*144.引物的GC含量和Tm值双链DNA的熔解温度为：( (T Tm)=4(G+C)+2(A+T)m)=4(G+C)+2(A+T)。GC含量对Tm的影响比AT含量显著。(1)引物与模板DNA互补结合区域的G+C含量应保持在4075%之间，以维持Tm在5662C范围内，使PCR反应时既能有效退火又有良好的特异性。(2)使引物对中两条引物的Tm差值尽可能小。*15 二、PCR反应条件的优化 以提高PCR反应的特异性、敏感性、忠实性和扩增效率为目标进行优化。1.变性条件的优化95C，2030秒即可使各种DNA分子完全变性。2.退火条件的优化*

5、比Tm值高312C为最佳，不应低于Tm值5C；2040秒。（见p11）*而实际的做法是，PCR反应时的退火温度设置一般为引物对的平均Tm减5C；2040秒。*163.延伸条件的优化延伸温度取决于所用DNA聚合酶的最适温度，通常为7075C；延伸时间取决于扩增片段的长度，一般5001200bp需时40秒。4.循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为2535次。5.增强剂6.热启动PCR:在加入Taq酶之前，先将PCR反应体系升温至95C,预变性2-5分钟,再加入Taq酶进行PCR反应，避免产生引物二聚体和非特异性配对 ( (一一) )反转录反转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR) 是从组织细胞中获得目的基因、对已知序列的mRNA进行定性及半定量分析的最有效方法，且灵敏、特异、简捷。总RNA(或mRNA) ss-cDNAds-cDNAPCR扩增*17第三节第三节 PCRPCR技术的基本类型及应用技术的基本类型及应用 一、PCR技术的基本类型1.RT-PCR反应体系：增加了反转录酶、模板RNA、引物2.RT-PCR反应基本步骤AAnATTnT 55mRNA反

6、转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly Iss-cDNA核酸酶S1(ds-cDNA)35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR大量的产物*18*19-actin目的片段目的片段*20限制酶切位点限制酶消化cosLRcoscosL左臂Rcos右臂限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装感染大肠杆菌7KbDNA片段cosLRcos7Kb外源cDNA片段cDNA文库gt10/11gt10/11系列系列 ( (插入型，适用于插入型，适用于cDNAcDNA克隆克隆) )cDNA片段*21重组噬菌体Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization. ( (二二) )原位原位PCR(in situpolymerasechainreaction, in situPCR)细胞涂片或石蜡包埋组织切片经组织固定处理后具有一定的通透性，PCR试剂包括Taq酶和引物等都可以进入细胞，以细胞内的靶DNA片段用为模板进行原位PCR扩增。*23 原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的倒置

7、。 结果可利用标记的引物进行原位PCR后可直接显色观察，或利用特异探针与扩增产物杂交后观察。操作步骤 1.1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般后便适于一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达 ( (三三) )反向反向PCR(reversepolymerasechainreaction, reversePCR)用与已知序列反向的互补引物来扩增两引物外侧的未知序列的片段。*25将含有已知序列的DNA在两侧的未知序列处用适当的内切酶切割后连接环化。RQ5353ExcitationRQQRQRExcitation*26 ( (四四) )实时定量实时定量PCR(qPCR) 在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。cDNAcDNACCCCCCCCCCCCCCCC末端核酸末端核酸转转移移酶酶CCCCCCCC 锚

8、锚定引物定引物3GGGG3GGGG553GGGG3GGGG5 5 3GGGG3GGGGCCCCCCCC先合成第一链cDNA后,添加一同聚物尾(polydG),与带有polydC限制性内切位点的3锚定引物一起扩增。*28 *( *(五五) )锚定锚定PCR 原理：设计“内、外” 两对引物：*(*(六六) )巢式巢式-PCR（nested-PCR） 先用外引物进行PCR反应，从模板上扩增出含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作为模板用内引物进行第二次PCR反应，扩增出内侧的较短靶序列。 外引物对应的序列在模板的外侧； 内引物对应的序列在外引物的内侧。*29第1轮PCR：1520个循环的标准扩增。第2轮PCR：将第1轮PCR扩增产物稀释1001000倍，作为模板进行第2轮PCR，扩增1520个循环。*30降低了多个靶位点扩增的可能性，因与2套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。可增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度，并且提高了困难PCR(如5 RACE)的特异性。 用外、内2对引物扩增，可大大提高扩增的灵敏度和特异性。*31*(*(七七) )

9、cDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增*323-RACE*335-RACE5-capAAAAAAAAAA3mRNAGSP11.逆转录去除RNA和GSP12.末端转移酶3CCCCC3CCCCC3.退火，PCR5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3Xho l Sal I ClaI3CCCCC5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3CCCCCGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3.PCR用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段*34*351.基因缺失的检测二、二、PCRPCR技术的实际应用技术的实际应用（一）基因结构分析*362.基因突变的检测3.基因易位的检测4.外源致病基因的检测(4)PCR-单链构象多态性分析(PCR-ASSCP)(3)PCR扩增特异的等位基因分析(PCR-ASA)(2)PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-ARFLP)(1)PCR-等位基因特异核酸探针法(PCR-ASO)(5)PCR-原位杂交(PCR-ASSCP) 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模

10、板获得已知目的基因片段。 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。u用不同引物进行PCR获取目的基因： （二）目的基因的克隆*37 *随机引物：含有各种可能排列顺序的6聚寡核苷酸片段的混合物。46=4096种 （三）序列分析（第四章 序列分析技术）*38(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT13OH5双脱氧核苷三磷酸脱去DNA链末端合成终止法电泳负极正极 测序反应 GATC（五）末端合成终止法测定DNA序列的原理*2，3双脱氧核苷酸*用4种不同荧光标记DNA样样品、引物DNA聚合酶、dNTPddGddAddTddC5 3 CCGATTTTTGCACCTGAGGCTAAAAACGTGGACTGGCTAAAddAAddAGGCTAAAAAddCGGCTAAAAACddGGGCTAAAAACGddTGGCTAAAAACGTddGGGCTAAAAACGTGddGGGCTAAAAACGTGGddAGGCTAAAAACGTGGAddCGGCTAAAAACGTGGA

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