第四章基因工程载体.ppt

vectors在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞的细胞的DNA分子分子叫载体一、一、载体载体 （（Vectors））广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体载工具叫载体（（1）具有对受体细胞的）具有对受体细胞的可转移性可转移性，可提高载体导入受体细胞的，可提高载体导入受体细胞的效率2）具有与特定受体细胞相适应的）具有与特定受体细胞相适应的复制原点复制原点或或整合位点整合位点，使得，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传3）具有）具有多种单一的核酸酶切位点多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点多克隆位点)，，可用于外源可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖4）具有合适的选择标记，便于重组）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测分子的检测5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害扩散，给人类造成危害2. 基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求3. 载体载体 的种类的种类 基因工程中基因工程中常用常用的载体有的载体有5类：类： 质粒（质粒（plasmid）） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13  噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）） 动物病毒（动物病毒（virus）） 来源来源功能功能克隆载体克隆载体: 克隆一个基因或克隆一个基因或DNA片段片段表达载体表达载体: 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）） 是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。

分子存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒（（1）分子小：）分子小： 1. 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1—500 kb（（2）编码基因少：）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质个中等大小的蛋白质 （（3）环形状：）环形状：双链环状双链环状DNA酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是RNA,编码毒性糖蛋白编码毒性糖蛋白）如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）一些额外的特性（非必须）（（4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型：① ① 共价闭合环状共价闭合环状DNA（（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil））Covalent close circular DNA③ ③ 线形线形DNA （（ linear ，，lDNA））一条链上有一至数个缺口一条链上有一至数个缺口② ② 开环开环DNA（（ open circular，， ocDNA））（（5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：型电泳迁移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。

最慢SCOCL（（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒）氯化铯密度梯度离心提取质粒超螺旋质粒超螺旋质粒开环和线性质粒开环和线性质粒染色体染色体DNA加入加入EB加入加入EB结合结合EB少少结合结合EB多多紧密密度高紧密密度高松散密度低松散密度低密度梯度离心分离密度梯度离心分离原原理理氯化铯密度梯度离心法步骤：氯化铯密度梯度离心法步骤：氯化铯密度梯度离心法步骤：氯化铯密度梯度离心法步骤： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加CsClCsCl和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下注射器吸取在紫外灯下注射器吸取在紫外灯下注射器吸取在紫外灯下注射器吸取cccDNAcccDNA稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNAproteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs过过过过Dowex AG50W-X8Dowex AG50W-X8柱子，用数倍体柱子，用数倍体柱子，用数倍体柱子，用数倍体积的积的积的积的TE/0.2mol/L NaCLTE/0.2mol/L NaCL清洗去除清洗去除清洗去除清洗去除EBEB二、质粒的类型二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒接合型质粒:非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移1、依据质粒自身传递的性质分类、依据质粒自身传递的性质分类除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌还带有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转接合转移移的基因。

的基因如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中转移到原先不存在该质粒的受体菌中又叫又叫自我转移型质粒自我转移型质粒1. 接合型质粒：接合型质粒：不符合基因工程的安全要求不符合基因工程的安全要求大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunction））2. 非接合型质粒：非接合型质粒：虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失所必需的遗传信息，但失去了控制去了控制细菌配对细菌配对和和质粒接合转移质粒接合转移的基因，的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞因此不能从一个细胞转移到另一个细胞1））R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（得同样的抗生素抗性性状（resistance）符合基因工程的安全要求符合基因工程的安全要求磺胺氨苄青霉素卡那霉素四环素链环素汞盐抗性带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin））合合成的基因成的基因2））Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。

质粒的大肠杆菌有毒Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒也可以成为接合型质粒2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类显性质粒显性质粒:宿主宿主细胞由于含有胞由于含有质粒而获得新性状质粒而获得新性状隐蔽质粒隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状宿主细胞含有此类质粒而无异样性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状A. 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid））拷贝数少拷贝数少，只有，只有1—3份拷贝B. 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid））拷贝数多拷贝数多，有，有10—60份拷贝接合型质粒分子量大，一般属严紧型）接合型质粒分子量大，一般属严紧型）非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）3、依据质粒的复制特性分类、依据质粒的复制特性分类三、质粒的不亲和性三、质粒的不亲和性亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒                     （攘外必先安内） 不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。

把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒（（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb但只有一个但只有一个EcoR I切点充当克隆位切点充当克隆位点，点，Tetr 作为筛选标志作为筛选标志ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（（colicin E1）2）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选但细菌群体容可以通过插入失活筛选但细菌群体容易自发突变出抗易自发突变出抗colicin E1的细胞的细胞…….colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，质粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个正好位于这个基因的内部基因的内部ColE1（（1）具有复制起点（）具有复制起点（ORI））2. 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件（（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（（3）若干限制性内切酶的单一位点：）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。

理想的载体应该有两是筛选的标志理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因种抗菌素抗性基因用来插入外源用来插入外源DNA片段且插入后不影片段且插入后不影响复制功能响复制功能（（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数3. 构建构建质粒克隆载体的基本原则质粒克隆载体的基本原则A、选用合适的出发质粒出发质粒（也称为亲本质粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、用于选择标记的基因、克隆位点 B、获得构建质粒克隆载体的元件 C、组装合适的选择标记基因 D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量 E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因 氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （（Kanr）） 四环素抗性四环素抗性 （（Tetr）） 链霉素抗性链霉素抗性 （（Strr）） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （（Cmlr））4. 质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：（（1）选择标记）选择标记① ① 抗菌素抗性抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：标记： 常用抗菌素的抗性工作原理常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（Ampicillin，，Amp））青霉素的衍生物。

青霉素的衍生物通过干扰细菌细胞壁合成的末端反通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死应，杀死生长的细菌生长的细菌a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码 -内酰胺酶内酰胺酶，特异地，特异地切割氨苄青霉素的切割氨苄青霉素的 -内酰胺环内酰胺环 ii）氯霉素（）氯霉素（chloramphenicol，，Cml））通过与通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀死死生长的细菌生长的细菌b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Cmlr 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉，特异地使氯霉素乙酰化而失活素乙酰化而失活a）抑菌原理）抑菌原理a）杀菌原理）杀菌原理iii）卡那霉素（）卡那霉素（kanamycin，，Kan））通过与通过与70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNA发发生错读杀死细菌杀死细菌b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Kanr 编码的编码的氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶，对卡，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用iv）链霉素（）链霉素（Streptomycin，，Str））a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与30S核糖体亚基结合，导致核糖体亚基结合，导致mRNA错译。

错译杀死细菌杀死细菌b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Strr 编码一种编码一种氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶对链对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚亚基结合作用基结合作用v）四环素（）四环素（Tetracycline，，Tet））b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通过于通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀死死生长的细菌生长的细菌Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内入细菌细胞内②② 遗传标记遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因使受体菌发生遗传性状的改变的基因营养标记营养标记其他标记：如蓝白斑筛选其他标记：如蓝白斑筛选当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌进入受体菌后，受体菌才能生长后，受体菌才能生长不带有不带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受体菌不能在的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。

生长2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素5. 5. 人工构建的人工构建的质粒粒载体的体的类型型（（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、、pMB1派生质粒具有高拷贝数派生质粒具有高拷贝数的特点而且在没有菌体蛋白质合成的条件下而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数数1000—30001000—3000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物大量的基因产物（（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生来的载体特点是分子量小，派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低拷贝数低当有些被克隆的基因的表达产物过多时会当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体pLG338、、pLG339、、pHSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNA用。

用（（3）失控的质粒载体）失控的质粒载体这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒温度低（低于温度低（低于35 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（>35 oC）时，拷贝数会很快增）时，拷贝数会很快增加到加到1000个以上如如pBEU1、、pBEU2runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建（（4）） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部标记基因内部如如pDF41、、pDF42、、pBR329抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNA无抗菌素抗性无抗菌素抗性（（（（5 5））））正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、、pTR262等只有带有选择标记基因的转化菌细胞才只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长能在选择培养基上生长直接选择转化后的细胞直接选择转化后的细胞目前通用的绝大部分质粒载体都是正目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体选择载体Direct selection vectorsSmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindⅢⅢKil基因Pkn80（17kb）PKN80质粒带有来自Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，它编码一种kil基因，使Mu噬菌体非溶源菌株致死。

 HindIII位点上插入外源DNA HindIII位点无插入外源DNA Kil基因无活性Kil基因有活性Mu噬菌体非溶源菌株致死Mu噬菌体非溶源菌株存活（（6）） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物主要用来使外源基因表达出蛋白质产物如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下翻译信号控制之下注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确密码、终止密码的阅读正确复制起始点复制起始点ORI、、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）） 转录终止信号区转录终止信号区1）普通载体元件）普通载体元件① ① 表达载体的表达载体的结构结构利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达中进行表达, ,该质粒载体应具备哪些元件该质粒载体应具备哪些元件? ?1 1）普通载体元件）普通载体元件）普通载体元件）普通载体元件复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点ORIORI、、、、 选择标记、选择标记、选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点MCSMCS2 2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因 I I 操纵基因操纵基因操纵基因操纵基因O O 启动基因启动基因启动基因启动基因P P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SDSD）））） 转录终止信号区。

转录终止信号区转录终止信号区转录终止信号区五、经典的大肠杆菌质粒载体五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型天然质粒，属低拷贝型2）长度）长度9.09 kb3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克隆位点： EcoR I、、Xho I、、Pvu I、、Hind III、、BamH I、、Sal I 主要使用主要使用EcoR I其中（其中Hind III、、BamH I、、Sal I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型天然质粒，属高拷贝型2）长度）长度6.3 kb3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin））E1和对和对E1免疫的基因（免疫的基因（immE1））特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞个细胞1000-30001000-3000拷贝之多！拷贝之多！①① colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因② ② 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物③③ 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（（ColE1-），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫免疫型（型（ImmE1+）。

EcoR I（（4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1作选择，操作非常繁杂作选择，操作非常繁杂 对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变敏感的细菌群体中自发突变产生抗产生抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（（5））ColE1的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1-仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1-插入片段插入片段ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：：（（1）元件来源）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体人工构建载体① ① 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1））的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点②② Ampr基因基因③ ③ Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因（（2）长度）长度4363bp（（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、、Hind Ⅲ、、Sal I）；）； 3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、、PvuI、、Pst I）。

24个克隆位点个克隆位点（（5））pBR322的优点的优点① ① 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④ ④ 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（（mobilization）不能通过接合转移不能通过接合转移③③ 高拷贝数高拷贝数② ② 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好载体越小越好 >10kb的的DNA在纯化过程中容易段裂在纯化过程中容易段裂保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点6））pBR322的缺点的缺点能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！① ① 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、、pAT153等）。

等）pAT153：：从从pBR322上切去上切去HaeII片段，既除去片段，既除去了了mob识别位点，又增加质粒的拷贝识别位点，又增加质粒的拷贝数7））PBR322的改进的改进pBR325：：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片段（带有氯霉酶切片段（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr） cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点使使EcoRI 也成为插入失活型位点也成为插入失活型位点②② 改造改造EcoR I 位点位点4. pUC系列系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成属正选择载体属正选择载体pUC7、、pUC8、、pUC9、、pUC10、、pUC11、、pUC18、、pUC19①① 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点但其上失去了克隆位点②② Ampr 基因基因（（1）元件来源）元件来源③ ③ lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌④ ④ lacZ’基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基端片段。

的氨基端片段pBR322的的Ampr基因基因（（2）长度）长度约约2.7kb（（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ’基因的基因的5’端Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白（蓝白斑）相结合斑）相结合4）选择标记）选择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理：①① Xgal（（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside）） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个分解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的的物质物质5-溴溴-4-氯靛蓝Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶② ②  -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应：显色反应：③ ③ lacZ的的 肽互补肽互补1）） -肽（肽（ lacZ’ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段端的一段氨基酸片段（（11-41氨基酸）氨基酸）lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变突变受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的氨半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解聚体的活性酶，不能分解Xgal 。

受体菌株：受体菌株：JM系列系列、、TG1、、TG2、、XL1-blue、、XS127、、XS101、、KK2186、、MV1184、、DH5apUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ’ 编码编码 肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使，使它能形成它能形成4聚体又能分解聚体又能分解Xgal产生蓝色物质蓝色物质C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ’ 受体菌受体菌lacZ∆3）载体）载体lacZ’与与 互补互补4）） 互补的插入失活互补的插入失活pUC载体上载体上LacZ’的的5’端有一段多克隆位端有一段多克隆位点点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ’的合成，的合成，但插入外源基因就会阻止但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成不能互补不能互补 lacZ’ 5’ 3’  肽移码突变肽移码突变lacZ’ 5’ 3’  肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNA④ ④ IPTG的诱导作用的诱导作用IPTG是乳糖的类似物能诱导是乳糖的类似物能诱导lac操操纵子的启动转录，使受体菌基因组中纵子的启动转录，使受体菌基因组中的的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ’ 肽肽都表达。

从而互补从而互补但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然不后，仍然不能产生能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入MCS无插入时，互补，蓝菌斑无插入时，互补，蓝菌斑 MCS有插入时，不互补，白菌斑有插入时，不互补，白菌斑IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的无质粒的无质粒的 受体菌受体菌受体菌受体菌   - - - -半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶部分缺失，不部分缺失，不部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解能分解能分解XgalXgalXgalXgal；；；；无抗菌素抗性无抗菌素抗性无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和XgalXgalXgalXgal的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养无菌斑无菌斑无菌斑无菌斑生长生长生长生长质粒转化质粒转化质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌的受体菌的受体菌   - - - -半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶的的的的缺失被载体产物缺失被载体产物缺失被载体产物缺失被载体产物   互补，能分解互补，能分解互补，能分解互补，能分解XgalXgalXgalXgal。

且有抗菌且有抗菌且有抗菌且有抗菌素抗性素抗性素抗性素抗性在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和XgalXgalXgalXgal的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养有蓝色有蓝色有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生菌斑生菌斑生长长长长带外源带外源带外源带外源DNADNADNADNA插插插插入的质粒转化入的质粒转化入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补不能互补不能互补   - - - -半半半半乳糖苷乳糖苷乳糖苷乳糖苷酶酶的缺的缺的缺的缺失不能分解失不能分解失不能分解失不能分解XgalXgalXgalXgal，但有抗，但有抗，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性菌素抗性菌素抗性在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和在含抗菌素和XgalXgalXgalXgal的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养的培养基上培养有白色有白色有白色有白色菌斑生菌斑生菌斑生菌斑生长长长长（（5））pUC系列载体的优点系列载体的优点① ① 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，，pUC8为为2750bp。

② ② 选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择显色、抗菌素双重直接选择③ ③ 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入方便地插入④ ④ 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序载体上测序M13mp18的多克隆位点的多克隆位点pUC18的多克隆位点的多克隆位点六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来派生而来与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别的两侧分别加了一个噬菌体加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ’ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录聚合酶识别转录①① 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在试管里就可以转录在试管里就可以转录mRNA② ② 外源基因正接反接都可以转录外源基因正接反接都可以转录③③ MCS与与pUC18的完全一样。

的完全一样2. pGEM-4Z：：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子的启动子的位置互换位置互换pGEM-3Z的特点：的特点：3. 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有人工构建的、具有两种不同复制起点两种不同复制起点和选和选择标记、可以在择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存两种不同的寄主细胞中存活和复制活和复制的质粒载体的质粒载体shuttle plasmid vectors））Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（（2 2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（（3 3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点② ② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达③ ③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

间来回转移基因克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell①① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达4、、TA克隆载体克隆载体   原理：Taq酶特点    研制出了一种线形质粒，其3 ’端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体 T vector的克隆过程的克隆过程——简便！简便！AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA 环化的质粒克隆载体环化的质粒克隆载体 TA克隆载体克隆载体姜颖等人于姜颖等人于2000年提出了一般质粒年提出了一般质粒克隆载体改造成克隆载体改造成TA克隆载体的方法克隆载体的方法（（（（1 1）克隆载体线性化克隆载体线性化克隆载体线性化克隆载体线性化限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶酚酚酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀10000r/min5min10000r/min5min离心离心离心离心双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解（（（（2 2）克隆载体末端补平反应。

克隆载体末端补平反应克隆载体末端补平反应克隆载体末端补平反应双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解加入加入加入加入dNTP(5mmol/L) 0.8dNTP(5mmol/L) 0.8μlμlKlenowKlenow缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液2 2μlμlKlenowKlenow酶酶酶酶1 1μlμl加水补齐至加水补齐至加水补齐至加水补齐至2020μlμl37°C37°C温育温育温育温育3h3h酚酚酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀4 4℃℃℃℃以以以以10000r /min10000r /min离心离心离心离心5min5min双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解（（（（3 3）克隆载体末端加）克隆载体末端加）克隆载体末端加）克隆载体末端加T T反应双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解MgCl2(25mmol/L)3MgCl2(25mmol/L)3μlμll, l,TaqTaq酶缓冲液酶缓冲液酶缓冲液酶缓冲液5 5μlμldTTP(20mmol/L) 2.5dTTP(20mmol/L) 2.5μlμlTapTapDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1μlμl加水至加水至加水至加水至5050μlμl7575℃℃℃℃温育温育温育温育2h2h酚酚酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀4 4℃℃℃℃以以以以10000r/ min10000r/ min离心离心离心离心5min5min双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解注意注意注意注意: :改造后的克隆载体与改造后的克隆载体与改造后的克隆载体与改造后的克隆载体与PCRPCR产物连接后，产物连接后，产物连接后，产物连接后，将克隆载体线性化的限制性核酸内切酶将克隆载体线性化的限制性核酸内切酶将克隆载体线性化的限制性核酸内切酶将克隆载体线性化的限制性核酸内切酶位点外的序列已经改变，不能再为该酶位点外的序列已经改变，不能再为该酶位点外的序列已经改变，不能再为该酶位点外的序列已经改变，不能再为该酶所识别。

所识别如果用产生如果用产生如果用产生如果用产生平末端平末端平末端平末端的限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶消化环形质粒，即可不必经过消化环形质粒，即可不必经过消化环形质粒，即可不必经过消化环形质粒，即可不必经过KlenowKlenow酶的补平反应酶的补平反应酶的补平反应酶的补平反应七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中配到两个子细胞中有主动分配和随机分配两种假说有主动分配和随机分配两种假说1）主动分配）主动分配天然质粒天然质粒2. 质粒分配方式质粒分配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（（Par），能以主动分配的方式确保质），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中粒能正确分配到两个子细胞中人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只，只能以随机分配方式分到子细胞中。

能以随机分配方式分到子细胞中人工质粒人工质粒一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象但在一定条件下会出现质粒丢失的现象在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体质粒的优势群体3. 分离的不稳定性分离的不稳定性（（segregation instability））4. 结构的不稳定性结构的不稳定性（（structural instability））寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失ISdimer重组重组（（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长约15%① ① 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比减缓的程度与质粒的分子量成正比② ② 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。

全相同，称差度2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因是产生无质粒细胞的重要原因高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大贝数的菌体多，发生丢失的可能性大野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作作用下会发生重组形成用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片段的质粒载体普遍含有大分子量插入片段的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体能形成质粒寡聚体二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控导致质粒失控第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性结构：结构： 蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着DNA（双链、单（双链、单链、线性、环状等）链、线性、环状等）。

single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNAT4 Bacteriophage护套分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌整合到细菌的染色体的染色体DNA中形成这一过程称为溶中形成这一过程称为溶源化（源化（lysogenization)整合到细菌染色体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为称为原原噬菌体噬菌体，随细菌的染色体复制而复制随细菌的染色体复制而复制温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)：：三、单链噬菌体载体三、单链噬菌体载体iii) M13、、f1、、fd 噬菌体噬菌体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：M13 噬菌体噬菌体（（2）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA。

1. 单链单链DNA噬菌体的特点噬菌体的特点（（3））RF DNA和和ssDNA都能都能转染转染感受态感受态 大肠杆菌并产生噬菌斑大肠杆菌并产生噬菌斑5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 段的段的单链分子单链分子，便于作探针或测序便于作探针或测序1））+DNAssDNA））（（4）不存在包装限制不存在包装限制2. M13 噬菌体噬菌体RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式在寄主细胞内以高拷贝形式存在成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也，也容易提取容易提取M13噬菌体只感染噬菌体只感染雄性雄性大肠杆菌大肠杆菌 但但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌可以转染雌性大肠杆菌6407 bp2））DNA长度长度（（3））DNA提纯提纯（（1）寄主）寄主M13序序列列（（4））M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的长变慢，约为正常的1/2—3/41/2—3/4））M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须性须注入其注入其+DNA+DNA合成－合成－DNA，形成，形成RF dsDNA－－DNA转录转录mRNA、合成、合成+DNA、翻译形、翻译形成噬菌体蛋白成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，，挤出寄主细胞挤出寄主细胞+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA每个细胞可以放出约每个细胞可以放出约10001000个个M13M13颗粒！颗粒！M13噬菌体噬菌体包装包装DNA分子的能力可达分子的能力可达M13DNA长度的长度的6倍。

倍5）没有包装限制）没有包装限制3. M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中只有基因基因组中只有基因II与基因与基因IV之间之间存在一段存在一段507bp的基因间隔区的基因间隔区1）克隆区域的选定）克隆区域的选定① ① 基因间隔区（基因间隔区（intergenic region, IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点其余其余9个个BsuI限制性位点分布在其它部位限制性位点分布在其它部位② ② 酶切位点酶切位点M13J. Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的的复制起复制起点点，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬噬菌体的活力菌体的活力在在IG区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（（ -肽序列肽序列) 利用利用 -肽序列中的三个单一酶切位点肽序列中的三个单一酶切位点（（Bgl II、、Ava II 和和 Pvu I）2）加入酶切位点）加入酶切位点①① 在在IG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个M13载体：载体：M13mp1：：M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各种长度的线性片段各种长度的线性片段（其中应有只在（其中应有只在IGIG上切开的线性上切开的线性全长全长M13M13））E.coli lac基因的基因的Hind II 片段片段(lacI、、lacP、、lacO、、lacZ’））连接连接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG区插入区插入lacZ’才能存活并才能存活并在在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑（（3））M13载体系列载体系列加上常用的酶切位点。

加上常用的酶切位点①① M13载体系列的命名载体系列的命名M13mpn n代表系列数字代表系列数字②② 对对M13mp1的改进的改进B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ’ 5’端的第端的第16个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个，产生了一个EcoR I切点M13mp2：：5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亚硝基脲亚硝基脲 把把G甲基化甲基化 5’ATGACCATGATTACGGATTCA-转染转染E.colimG与与T配对，复制两次后配对，复制两次后 5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点切点用用EcoRI切切M13mp1M13mp2选择能切开的选择能切开的 线性分子线性分子再环化再环化M13mp1③③ 对对M13mp2的进一步改进的进一步改进在在M13mp2的的LacZ’的的5‘端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位点（合成的多克隆位点（MCS）M13mp7、、M13mp8、、M13mp9、、M13mp10、、M13mp11、、M13mp18、、M13mp19对应有相同对应有相同MCS的的pUC系列载体：系列载体：pUC7、、pUC8、、pUC9、、pUC10、、pUC11、、pUC18、、pUC19成为成为M13mp系列载体：系列载体：12与与pUC18相同相同M13mp18的多克隆位点的多克隆位点4. M13系列载体的优点系列载体的优点（（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（（2）） Xgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择（（3）无包装限制，克隆能力大）无包装限制，克隆能力大（（4）可以克隆双链）可以克隆双链DNA分子中的每一条链分子中的每一条链子代子代M13噬菌体中包含的是单连噬菌体中包含的是单连+DNA。

MCS+-+-+-编码链编码链非编码链非编码链外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源外源DNA转染转染E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中++①① 插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降后，遗传稳定性显著下降② ② 实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp1500bp虽无包装限制，虽无包装限制，并非无限包装！并非无限包装！5. M13载体的缺点载体的缺点6. 噬菌粒载体（噬菌粒载体（phagemid vectors））由由质粒载体质粒载体与与单链噬菌体载体单链噬菌体载体的复制起点的复制起点结合而成的新型载体系列结合而成的新型载体系列MCS噬菌体噬菌体ori质粒质粒oriAmprlacZ’ lacI约约3000bp（比（比M13小）小）②②克隆能力大克隆能力大能插入能插入10kb的外源的外源DNA③③两种复制形式两种复制形式①①分子量小分子量小（（1）噬菌粒载体的特点）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点的复制起点既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

又能在噬菌体内进行单链复制（（2）常见的噬菌粒载体）常见的噬菌粒载体噬菌粒载噬菌粒载噬菌粒载噬菌粒载体体体体质粒部分质粒部分质粒部分质粒部分单链噬菌单链噬菌单链噬菌单链噬菌体部分体部分体部分体部分辅助噬菌辅助噬菌辅助噬菌辅助噬菌体体体体大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌寄主寄主寄主寄主pEMBL8pEMBL8pUC8pUC8f1f1IR1IR171/1871/18pRSA101pRSA101   VXVXM13M13M13M13变异变异变异变异株株株株XS127XS127，，，，XS101XS101pUC118/ppUC118/pUC119UC119pUC18/ pUC18/ pUC19pUC19M13M13M13K07M13K07MV1184MV1184pBSpBSpUCpUCf1f1M13K07M13K07XL1-BlueXL1-Blue辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体（（3））pUC118/pUC119① ① 构成构成1））M13的基因间隔区（的基因间隔区（IG））2））pUC18/pUC19质粒载体：质粒载体：带有带有M13复制起点。

复制起点质粒复制起点质粒复制起点 Ampr lacZ’ MCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZ’ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119②② pUC118/119的复制模式的复制模式两种不同的复制模式两种不同的复制模式1）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式受受pUC本身的复制起点（来源于本身的复制起点（来源于ColE1）的控制每个细胞能达到每个细胞能达到500500个拷贝来源于来源于M13的复制起点被的复制起点被辅助噬菌体辅助噬菌体的基因的基因II产物控制产物控制2）单链滚环噬菌体复制模式）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白外壳蛋白复制蛋白复制蛋白辅助辅助M13包装包装当寄主细胞被当寄主细胞被辅助噬菌体辅助噬菌体M13感染后③ ③ 噬菌粒载体的包装噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体：）辅助噬菌体：自身的自身的复制起点发生了突变复制起点发生了突变，复制效率低，复制效率低下，但感染细菌后能表达出下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复外壳蛋白和复制蛋白制蛋白，帮助噬菌粒载体复制帮助噬菌粒载体复制如如M13K07等2）包装：）包装：辅助噬菌体辅助噬菌体外壳蛋白和外壳蛋白和 复制蛋白复制蛋白噬菌粒载体噬菌粒载体ssDNA噬菌体噬菌体（（4））pBluescript 噬菌粒载体（噬菌粒载体（pBS））Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。

公司发展的一类噬菌粒载体由由pUC质粒载体、质粒载体、f1噬菌体的复制起点和噬菌体的复制起点和T3、、T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子组成② ② 特点特点① ① 组成组成MCS两侧分别加上两侧分别加上T3和和T7噬菌体的噬菌体的启动子加入适当的噬菌体启动子加入适当的噬菌体RNA聚聚合酶，就可以定向体外转录合酶，就可以定向体外转录1）定向体外转录）定向体外转录2）两种复制模式）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装菌体的形式复制包装3）选择方便）选择方便有有Ampr和和lacZ’，可以进行，可以进行Amp抗性抗性选择和选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择蓝白斑选择4）插入方便）插入方便18个单一酶切位点的个单一酶切位点的MCSSK：表示：表示lacZ’的的转录方向转录方向是沿是沿MCS上的上的 SacI  KpnI +（（f1+）：单链）：单链复制起始方向复制起始方向背离背离 lacZ’，能回收，能回收lacZ’的编码链（的编码链（+））pBluescript SK（（+/-））/pBluescript KS（（+/-））KS：反向（：反向（ KpnI  SacI ，，MCS相反）相反）-（（f1-）：能回收）：能回收lacZ’的非编码链（的非编码链（-））1））pBluescript SK/KS（（+/-）区分：）区分：③③ 常用的常用的 pBluescript 载体载体pBS SK+pBS KS-（（5）噬菌粒）噬菌粒T 载体载体pCR系列载体系列载体Invitrogen公司开发的公司开发的线性线性噬菌粒载体。

噬菌粒载体① ① 结构结构pUC的质粒部分、的质粒部分、 f1噬菌体噬菌体ori、、Kanr和和Ampr抗性MCS的中部已经切开，各有一个的中部已经切开，各有一个3’端突出的端突出的T② ② 特点特点PCR产物往往在产物往往在3’端突出一个端突出一个A，所，所以能与这个载体直接连接以能与这个载体直接连接pCR2.1pCR2.1的的MCS克隆的克隆的PCR产物能被两侧的产物能被两侧的EcoRI切下来回收切下来回收Promega 公司公司T载体系列载体系列pGEM-T vectorpGEM-T EasyvectorpTarget vectorG418抗性抗性可在真核生物表达可在真核生物表达 pTARGETTM 载体包含巨细胞病毒CMV早期增强子/启动子，可启动基因在多种细胞中高水平表达这个载体还包含一个新霉素磷酸转移酶基因(Neo)，可用抗生素G- 418筛选细胞稳定表达株 Promega 公司公司T载体系列载体系列7. 噬菌体展示载体（噬菌体展示载体（ Phage display vector））（（1）噬菌体展示（）噬菌体展示（Phage display））将外源蛋白（多肽、酶、抗体、将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面噬菌体的外表面。

G. P. Smith1985年发明丝状噬菌体（丝状噬菌体（M13、、f1等）外壳颗粒的等）外壳颗粒的一端，有一端，有3-5个基因个基因Ⅲ编码的蛋白质编码的蛋白质（（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用程中起作用M13（（2）噬菌体展示载体的构建）噬菌体展示载体的构建把外源把外源DNA片段插入基因片段插入基因ⅢⅢ的序列的序列前端前端，，并保持两者的阅读框正确，表达出融合并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白启动子启动子外源外源DNAM13基因基因ⅢⅢoriM13 display vector外源外源多肽多肽四、双链噬菌体载体四、双链噬菌体载体— 载体载体（（1）长度为）长度为48502 bp；； （（2）双链线性）双链线性DNA；； （（3）但在两端有）但在两端有cos位点，可以环化位点，可以环化 DNA两端各有两端各有12bp的粘性末端，粘性末的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为端形成的双链区域称为cos位点1.  DNA分子的特点分子的特点 cos位点（位点（cohensive-end site）：）： DNA进入细菌体内后，可形成双链环状进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（复制型（RF DNA）。

 噬菌体和其噬菌体和其DNAlDNA上有至少上有至少61个基因，有一半是必须的，个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列与自身的活动有关，成簇排列 其他约其他约1/3是是非必须基因（非必须基因（位于尾部合成至阻位于尾部合成至阻遏蛋白基因之间的区段）遏蛋白基因之间的区段）2.  噬菌体的基因组特点噬菌体的基因组特点    genome(48502bp) 噬菌体感染细菌的早期：双链进行噬菌体感染细菌的早期：双链进行 型复制3.  DNA的复制模型的复制模型（（1））  型复制型复制（（2）滚环复制）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制感染的晚期：启动滚环复制机制形成多联体形成多联体 DAN分子滚环滚环复制复制这种多联体分子必须在这种多联体分子必须在cos位点被切断位点被切断成单体分子才能被包装起来成单体分子才能被包装起来（（1）构建原理：）构建原理：4.  噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（（2）构建过程）构建过程①①在这个非必须区内制造限制酶切点在这个非必须区内制造限制酶切点 ②②引进某些突变表型，作为选择标记引进某些突变表型，作为选择标记 ③③突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体 ④④删除删除 DNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点 噬菌体噬菌体DNA上本身有上本身有5个个 EcoR I 和和7 个个Hind III切点！切点！删除删除 噬菌体的非必需区，留出插入空间。

噬菌体的非必需区，留出插入空间（（3））人工构建的人工构建的 噬菌体载体有两种类型：噬菌体载体有两种类型：① ① 插入型载体（插入型载体（insertion vectors)：：如如  gt10、、 gt11、、 BV2、、 NM540、、 NM1590、、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性插入位点位于载体合成活性阻遏物区阻遏物区域域（（cI基因）内基因）内EcoR IcI gt10插入导致载体不能合成阻遏物，插入导致载体不能合成阻遏物， 载体载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清清晰的噬菌斑晰的噬菌斑 没有外源没有外源DNA插入的插入的 载体感染受体菌形成载体感染受体菌形成混浊噬菌斑混浊噬菌斑选择标记选择标记:如如 NM1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因内部基因内部2）） -半乳糖苷酶失活型载体：半乳糖苷酶失活型载体：在在 基因组中引入了基因组中引入了LacZ’序列。

其上含有序列其上含有一个一个EcoR I 克隆位点）克隆位点）感染感染LacZ突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，的诱导，利用利用Xgal的显色反应的显色反应作选择标记作选择标记LacZ’LacZ’ EcoR ICharon16A选择标记选择标记:②② 替换型载体（替换型载体（substitution vectors)í 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于于 DNA的非必须区两端的非必须区两端用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源用同样酶切成的外源DNADNA片段置换片段置换可置换区可置换区MCSMCS如：如：   EMBL4、、Charon40等131））  EMBL4  EMBL4的可置换片段内部还有的可置换片段内部还有Sal I酶切酶切位点以便于进一步消化中间片段，防止自我连接以便于进一步消化中间片段，防止自我连接左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂EcoR I BamH I Sal ISal I BamH I EcoR ISal I Sal I EMBL42））Charon40Charon40的可置换片段是由的可置换片段是由DNA短片短片重复构成，片段之间有重复构成，片段之间有Hae I 切点切点。

在克隆的时候，可以用在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置酶进一步将可置换片段切成小片段，以防止重新与载体连接换片段切成小片段，以防止重新与载体连接左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片段中如果包含可取代片段中如果包含LacZ’，可用，可用Xgal显色显色作筛选标记作筛选标记4）） 载体的筛选标记载体的筛选标记② ② 插入型载体插入型载体根据插入所引起的表型突变根据插入所引起的表型突变① ① 置换型载体置换型载体 载体克载体克隆策略隆策略置换型载体置换型载体  DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低率远比质粒低5.  载体的体外包装载体的体外包装 在试管中与在试管中与 噬菌体的噬菌体的头部头部和和尾部尾部蛋白人蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组细菌，把重组DNA注入受体菌中注入受体菌中必须利用噬菌体外壳的作用！必须利用噬菌体外壳的作用！（（1）体外包装：）体外包装： l 的的D基因的产物也是头部蛋白，但主基因的产物也是头部蛋白，但主要与要与  DNA 进入头部和头部的成熟有进入头部和头部的成熟有关（只占关（只占20%）。

2）体外包装过程）体外包装过程① ①  噬菌体外壳蛋白的合成噬菌体外壳蛋白的合成E 基因基因l的的E 基因编码头部蛋白的主要成基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的分（占头部总蛋白的70%）D基因基因E基因基因突变突变只合成尾部只合成尾部蛋白和包装蛋白和包装识别蛋白识别蛋白D基因基因突变突变合成头部蛋合成头部蛋白和尾部蛋白和尾部蛋白，但不能白，但不能聚合和包装聚合和包装DNA提取尾部蛋提取尾部蛋白和包装识白和包装识别蛋白别蛋白提取头提取头部和尾部和尾部蛋白部蛋白重组的重组的 载体载体DNA体外包装体外包装成活性噬成活性噬菌体菌体外源的重组外源的重组 DNA载体被诱发与内源载体被诱发与内源性原性原 DNA发生重组发生重组3）体外包装存在的问题：）体外包装存在的问题：① ① 包装错误：包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的既能包装用于生产头部蛋白的内源性原内源性原 DNA，也能包装，也能包装重组的重组的 DNA载体载体② ② 重组：重组：③ ③ 体外包装的容量限制：体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的必须在正常野生型容量的75%—105% （（36—51kb））之间。

之间既不能超过正常野生型容量的既不能超过正常野生型容量的5%5%；； 又不能低于正常野生型容量的又不能低于正常野生型容量的75%75%野生型野生型 DNA的必须区是的必须区是28kb，所以，所以 载体的最大克隆容量是载体的最大克隆容量是23kb实际上实际上为为15kb）比一般的质粒载体的容量大的多比一般的质粒载体的容量大的多 （（4）） DNA载体的优点载体的优点用在真核生物基因组文库的建立用在真核生物基因组文库的建立Sau3ABamHI噬菌体感染细菌形成的噬菌斑噬菌体感染细菌形成的噬菌斑1978年年J. Collins和和B. Hohn等人发展出等人发展出cosmid vector（（cos site-carrying plasmid)  DNA：：4—6kb（（1）大小）大小 （（2）组成）组成 6. cosmid载体（粘粒）载体（粘粒）cos序列和控制包装的序列序列和控制包装的序列pBR322：：质粒的复制子质粒的复制子 抗药性基因抗药性基因 几个限制性酶的单一位点几个限制性酶的单一位点pHC79①①具有具有 噬菌体的特性：噬菌体的特性：（（3））cosmid vector的特点的特点 克隆外源克隆外源DNA后可以后可以体外包装体外包装成噬菌成噬菌体颗粒。

体颗粒在寄主细胞内形成环化在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）②②具有质粒载体的特性：具有质粒载体的特性：大多带有大多带有pMB1或或ColE1的复制子，的复制子，能象质粒一样复制能象质粒一样复制有抗菌素抗性基因，和插入失活的有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点克隆位点③③方便的选择：方便的选择：④④高容量的克隆能力：高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于（最少不能低于30kb）（（4）部分）部分cosmid vectorCosmid Cosmid 载体载体载体载体复制复制复制复制子子子子大小大小大小大小（（（（kb)kb)选择标选择标选择标选择标记记记记克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点克隆能克隆能克隆能克隆能力力力力（（（（kb)kb)c2XBc2XBpMB1pMB16.86.8AmpAmpr r, , KanKanr r BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaIPstI, SmaI32~4532~45pHC79pHC79pMB1pMB16.46.4AmpAmpr r , , TetTetr r EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalIPstI, CalI29~4629~46pHS262pHS262ColE1ColE12.82.8KanKanr r BamHI, EcoRI, HincIIBamHI, EcoRI, HincII34~5034~50pJC74pJC74ColE1ColE115.815.8AmpAmpr r EcoRI, BamHI, BglII, SalIEcoRI, BamHI, BglII, SalI21~3721~37pJC75-pJC75-5858ColE1ColE111.411.4AmpAmpr rEcoRI, BamHI, BglIIEcoRI, BamHI, BglII16~4216~42pJC74mpJC74mColE1ColE12121AmpAmpr r, , KanKanr rBamHIBamHI16~3216~32pJC720pJC720ColE1ColE17.17.1Elimm, Elimm, RifRifr r HindIII, XmaIHindIII, XmaI11~2811~28Cosmid Cosmid 载体载体载体载体复制复制复制复制子子子子大小大小大小大小（（（（kb)kb)选择选择选择选择标记标记标记标记克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点克隆能克隆能克隆能克隆能力力力力（（（（kb)kb)pJC81pJC81pMB1pMB17.17.1AmpAmpr r, , TetTetr rKpnI,BamHI,HindIII,KpnI,BamHI,HindIII,SalISalI30~4630~46pJB8pJB8ColE1ColE1 5.45.4AmpAmpr r BamHI,HindIII,SalIBamHI,HindIII,SalI31~4731~47MuA-3MuA-3pMB1pMB14.84.8TetTetr rPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuIIPvuII32~4832~48MuA-10MuA-10pMB1pMB14.84.8TetTetr rEcoRI,BalI,PvuI,PvuEcoRI,BalI,PvuI,PvuI I32~4832~48pTL5pTL5pMB1pMB15.65.6TetTetr rBglII,BalI,HpaIBglII,BalI,HpaI31~4731~47pMF7pMF7pMB1 pMB1 5.45.4AmpAmpr r EcoRI,SalIEcoRI,SalI32~4832~48应用应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组片段的真核基因组DNA技术，叫技术，叫“柯柯斯克隆斯克隆”（（cosmid cloning）。

5））cosmid cloning ①①理论依据：理论依据：cos位点位点: 噬菌体的生命周期中，会产生数百个噬菌体的生命周期中，会产生数百个 DNA通过通过cos位点连接的位点连接的“多联体多联体”分子多联体多联体”复制：复制：包装识别包装识别在包装的时候，在包装的时候，  噬菌体具有位点特异噬菌体具有位点特异的的末端酶（末端酶（terminase）体系）体系（（Ter体系）体系），识别，识别cos位点，把多联体切成单个位点，把多联体切成单个 DNA长度两个两个cos位点之间，必须保持位点之间，必须保持38—45kb的的DNA，，Ter体系才能识别野生型体系才能识别野生型 噬菌体噬菌体DNA的的75％％——105％Ter体系：体系：包装限制：包装限制：①①用特定的核酸内切酶消化真核生物用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA6））cosmid克隆的一般过程克隆的一般过程②②用同样的内切酶消化用同样的内切酶消化cosmid载体产物中将有一定比例的分子是两端各产物中将有一定比例的分子是两端各有一个有一个cos位点、长度位点、长度40kb左右的真左右的真核核DNA与载体的连接物。

与载体的连接物③③连接连接切割切割合适长度合适长度的杂种的杂种DNA连接物，并包连接物，并包装入噬菌体头部装入噬菌体头部注入到细菌体内的杂种注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，分子环化，并按质粒的方式复制并按质粒的方式复制⑤⑤感染大肠杆菌感染大肠杆菌④④ Ter体系识别并切割体系识别并切割大质粒！大质粒！①①载体片段自我连接载体片段自我连接②②外源外源DNA片段自我连接片段自我连接③③多个本来不在一起的外源多个本来不在一起的外源DNA片段连接片段连接起来同时插入载体起来同时插入载体7））cosmid载体克隆的缺点载体克隆的缺点用用碱性磷酸酶碱性磷酸酶除去线性质粒片段除去线性质粒片段5’端的磷端的磷酸，可防止载体自体连接酸，可防止载体自体连接克服载体自体连接的改良方案：克服载体自体连接的改良方案：① ① Ish-Horowice—Burke改良方案改良方案1981年，年，D. Ish-Horowice和和J.F. Burke 8））cosmid载体的改良载体的改良在在BamH I位点两侧各有一个位点两侧各有一个EcoR I切点1）突出的特点：）突出的特点：pJB8 cosmid载体载体使克隆在使克隆在BamH IBamH I上的外源上的外源DNADNA可被可被EcoR EcoR I I切下来。

切下来包装识别包装识别2 2））））Ish-Horowice—BurkeIsh-Horowice—Burke方案克隆过程方案克隆过程方案克隆过程方案克隆过程a. 需要脱磷酸化处理需要脱磷酸化处理b. 电泳纯化载体两臂电泳纯化载体两臂c. 载体两臂的最终得率少的可怜！载体两臂的最终得率少的可怜！2））Ish-Horowice—Burke方案的缺点方案的缺点防止载体自我连接防止载体自我连接第二次酶切后第二次酶切后1983年年P.F. Bates和和R.A. Swift② ② Bates---Swift 改良方案改良方案a. 具有两个具有两个cos位点SmaI平端的连接效率低，阻止了平端的连接效率低，阻止了载体臂的自我连接载体臂的自我连接，增加了外源，增加了外源DNA的连接效率的连接效率1）特点：）特点：b. 一个一个SmaI切点把两个切点把两个cos位点分开位点分开c. BamHI克隆位点克隆位点c2XB cosmid载体载体Bates---Swift Bates---Swift 克隆过程：克隆过程：克隆过程：克隆过程：第三节第三节 大分子大分子DNA克隆载体克隆载体A.W.Murray 1983年形成基础理论年形成基础理论, D.T.Burke等等1987年变为现实。

年变为现实一、酵母人工染色体一、酵母人工染色体1. YAC的特点：的特点：（（1）只能在酵母细胞中扩增只能在酵母细胞中扩增yeast artificial chromosome, YAC)（（2）克隆容量大，为）克隆容量大，为230kb-1700kb3）构建原理，按染色体结构构建构建原理，按染色体结构构建（（1））DNA复制起始点（复制起始点（ori）） 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI（（2）着丝粒（）着丝粒（centromere，，cen））（（3）两个端粒（）两个端粒（telomeres，，tel））LeuARSCENLeu- Yeast后代死后代死Leu- Yeast80%后代死后代死Leu- Yeast后代活后代活Leu- Yeast后代死后代死Leu- Yeast后代活后代活TelTel（（1）着丝粒区（）着丝粒区（CEN））A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA3. YAC的组成结构的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列酵母染色体着丝粒区的保守序列:78-86bpIIIIII由三个区组成由三个区组成酵母第酵母第3、、4、、6、、11号染色体的着丝粒区序列：号染色体的着丝粒区序列：酵母酵母端粒保守序列端粒保守序列是是(G4T2)n 重复序列。

重复序列3）复制起点（）复制起点（ORI））约约100bp的自主复制序列（的自主复制序列（ARS）2）端粒（）端粒（TEL））人是人是TTAGGG重复序列重复序列; 四膜虫是四膜虫是 GGGTTG重复序列重复序列真核生物中只有酵母菌有（真核生物中只有酵母菌有ARS））两个端粒序列两个端粒序列Tel位于位于 SUP4 基因内部基因内部4）克隆位点）克隆位点插入失活选择：插入失活选择：SUP4酶失活的酵母酶失活的酵母菌落呈菌落呈红色；红色； 不失活的菌落是白不失活的菌落是白色Sup4 基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制tRNATYR(酪氨酸酪氨酸)，抑制赭色表型，抑制赭色表型 (成为白色成为白色)不含外源不含外源DNA片段的片段的YAC载体转化酵载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色母菌，转化子的菌落呈白色插入的外源插入的外源DNA片段的片段的YAC重组载体，重组载体，其其Sup4已经失活，结果转化酵母菌已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落后所产生的转化子形成赭色菌落 TRP1、、URA3（分别位于两臂）（分别位于两臂）细菌的复制起点细菌的复制起点 ori和抗生素标记和抗生素标记Ampr （（5）在酵母中的标记基因）在酵母中的标记基因（（6）在细菌中操作）在细菌中操作色氨酸色氨酸尿嘧啶尿嘧啶4. YAC克隆克隆外源外源DNAURA3TRP1 CEN4（（1）宿主酵母菌：）宿主酵母菌： 只有同时得到只有同时得到YAC的的两个臂两个臂，才能在基，才能在基本培养基（不加本培养基（不加TRP和和URA）上生长。

上生长2）选择方式）选择方式5. YAC转化过程转化过程trp- 和和 ura-cenura3trp1（（1）存在插入子的稳定性问题存在插入子的稳定性问题6. YAC的缺点：的缺点：（（2）同一酵母细胞内多个）同一酵母细胞内多个YAC引起交换引起交换（（3）转化效率低转化效率低4）难以制备纯的）难以制备纯的YAC-DNA结合组蛋白结合组蛋白H. Shizuya等等1992年在大肠杆菌年在大肠杆菌F因子因子的基础上构建的的基础上构建的2）克隆容量可达）克隆容量可达300kb二、细菌人工染色体（二、细菌人工染色体（BAC））1. F质粒的特点：质粒的特点：每细胞只有一个拷贝，不会重组每细胞只有一个拷贝，不会重组4）便于提纯）便于提纯像提取质粒一样直接提纯像提取质粒一样直接提纯1）单拷贝复制单拷贝复制3）比较稳定比较稳定（（1））OriS和和repE控制质粒的单向复制控制质粒的单向复制 （（2））parA和和parB维持低水平质粒拷贝数维持低水平质粒拷贝数2. BAC的组成结构的组成结构（（3））CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点是噬菌体末端酶专一性切割位点 （（4））loxP位点（噬菌体位点（噬菌体P1 Cre蛋白进行定点蛋白进行定点重组的作用位点）。

重组的作用位点） （（5））HindIII和和BamHI是插入位点是插入位点 （（6）两侧的）两侧的NotI可用于切下外源可用于切下外源DNA7）氯霉素抗性基因）氯霉素抗性基因CMR第四节第四节 病毒载体病毒载体一、反转录病毒载体一、反转录病毒载体1.1.反转录病毒（反转录病毒（ritrovirus））属于正链属于正链RNA病毒，显著的特点是具有病毒，显著的特点是具有2倍体基因组倍体基因组 两个相同的两个相同的RNA分子在分子在5’端附近经氢键连端附近经氢键连接形成接形成70S RNA，这种结构可能在逆转录，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用过程中起调节作用反转录病毒结构反转录病毒结构Influenza virusHIV类似于真核细胞类似于真核细胞mRNA2. 反转录病毒的基因组结构反转录病毒的基因组结构envpolgagU3U3U5U5cappolyA3’ 5’ LTRLTRRR +Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)长末端重复序列。

在病毒基因组整合中至关重要长末端重复序列在病毒基因组整合中至关重要整合时，整合酶在整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链连接处切开双链DNA，随，随机插入到宿主基因组里机插入到宿主基因组里 LTR本身还具有启动子和本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能加尾信号的功能LTR：： +：组装时必需的非编码序列：组装时必需的非编码序列 env：外壳蛋白外壳蛋白 pol：反转录酶和整合酶反转录酶和整合酶 gag：核心蛋白核心蛋白envpolgagU3U3U5U5cappolyA3’ 5’ LTRLTRRR +U5、、U3：：5’段或段或3’端独特序列端独特序列3. 反转录病毒载体构建反转录病毒载体构建（（1）删除）删除pol、、env和和gag基因 5’LTR  +外源基因外源基因neor3’LTR启动子启动子（（2）插入标记基因（如）插入标记基因（如neor）3）外源基因和启动子插入到）外源基因和启动子插入到 +下游4.4.反反转录病毒病毒载体的包装体的包装反转录病毒反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，转化细胞的效率很低，必须包装成必须包装成病毒颗粒病毒颗粒转染细胞。

转染细胞用两个用两个缺失了缺失了 +的反转录病毒染色的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白 （（1 1）包装细胞系的构建）包装细胞系的构建5’LTRgag3’LTRpolenv3’LTR5’LTR5’LTRgag3’LTRpolenv3’LTR5’LTR病毒外壳蛋白病毒外壳蛋白包装细胞包装细胞（（2）载体）载体RNA的包装的包装①①用载体用载体DNA转化包装细胞系转化包装细胞系转入的载体转入的载体DNA上带有上带有 +，，转录成的载转录成的载体体RNA就会被包装细胞中原有的就会被包装细胞中原有的病毒外病毒外壳蛋白壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒识别包装成重组病毒颗粒 5’LTR  +外源基因外源基因neor3’LTR高效转高效转染靶细染靶细胞胞5. 5. 反反转录病毒病毒载体的体的优点点（（1）将）将DNA插入宿主基因组的随机位点上插入宿主基因组的随机位点上 （（2）侵染范围广、感染率高侵染范围广、感染率高 （（3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定， 拷贝数目较低拷贝数目较低 （（4）包装的外源）包装的外源DNA可达可达10kb。

（（5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主 细胞没有毒性细胞没有毒性反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞二、二、DNA病毒载体病毒载体腺病毒（腺病毒（adenovirus））1. 腺病毒的基因组腺病毒的基因组线状双链线状双链DNA病毒，基因组中有病毒，基因组中有14个基个基因 共同特点是都带有倒置的末端重复共同特点是都带有倒置的末端重复（（ITR），在病毒的复制过程中起非常），在病毒的复制过程中起非常重要的作用重要的作用（（1 1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用比较安全，无致病、致癌、致畸作用 （（2 2）宿主范围广）宿主范围广2. 腺病毒的优点腺病毒的优点不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）染不能分裂的细胞（如神经细胞）4 4）载体中的插入片段可达）载体中的插入片段可达7.5kb 7.5kb （有包装容量限制）有包装容量限制） （（5 5）腺病毒容易制备、纯化腺病毒容易制备、纯化 （（6 6）基因组结构和功能了解得清楚。

基因组结构和功能了解得清楚3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染可以通过口服或喷雾的方式感染3. 腺病毒载体腺病毒载体是目前最常用的基因治疗载体之一是目前最常用的基因治疗载体之一1）腺病毒载体的构建）腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因用同源重组的方法插入外源基因①①删除腺病毒删除腺病毒DNA一些非必需区一些非必需区ITRE1ITRE3如如E1或或E3区，增加插入能力区，增加插入能力E1或或E3缺失病毒缺失病毒含有含有E1或或E3区区两侧的同源序列两侧的同源序列在同源序列之间在同源序列之间插入外源基因和插入外源基因和选择标记基因选择标记基因②②构建质粒载体构建质粒载体③③把质粒切成线性把质粒切成线性④④共同转染细胞共同转染细胞在细胞中发生同源重组，把外源在细胞中发生同源重组，把外源DNADNA加到病毒加到病毒基因组中，并包装成基因组中，并包装成重组病毒颗粒重组病毒颗粒质粒与病毒质粒与病毒DNA（缺失（缺失E1或或E3））4. 重组腺病毒重组腺病毒DNA在细胞中的生存在细胞中的生存（（1 1））以游离的附加体形式存在于细胞中以游离的附加体形式存在于细胞中 不能整合到细胞基因组中。

基因表达不能整合到细胞基因组中基因表达时间短2））E1是腺病毒繁殖的必需区是腺病毒繁殖的必需区缺失缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖3））E3区对腺病毒的繁殖不是必需的区对腺病毒的繁殖不是必需的缺失缺失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒的重组腺病毒不需要辅助病毒第五节第五节 基因打靶载体（基因打靶载体（Targeting vector））通过通过DNA同源重组，使细胞同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因定的位点插入外源基因一、基因打靶（一、基因打靶（gene targeting））基因敲出（基因敲出（knock-out））基因敲入（基因敲入（knock-in））二、基因打靶载体的要求二、基因打靶载体的要求1. 要求能整合到染色体上特定的位置要求能整合到染色体上特定的位置2. 整合的位置尽量选在基因组内编码非必整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方需产物的地方3. 必需整合在基因组中可以转录的区域。

必需整合在基因组中可以转录的区域定点整合定点整合1. 两段同源两段同源DNA序列（序列（HB1和和HB2））2. 目的基因目的基因三、基因打靶载体组成三、基因打靶载体组成3. 编码抗编码抗G418的基因（的基因（neor））4. 胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（HSV-tk1和和HSV-tk2））与靶位点两端的区域同源与靶位点两端的区域同源新霉素（新霉素（neomycin）磷酸转移酶基因）磷酸转移酶基因分别来自分别来自I型和型和II型单纯疱疹病毒（型单纯疱疹病毒（HSV）载体载体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体四、载体的整合方式四、载体的整合方式染色体染色体DNAHB1染色体染色体DNAHB2染色体染色体DNA载体载体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体染色体染色体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2染色体染色体两个两个tk基因基因至少有一个至少有一个可能整合到基因组里可能整合到基因组里细胞被细胞被tk基因杀死基因杀死1. 非特异整合非特异整合——非同源重组非同源重组2.2.特异位点整合特异位点整合————同源重组同源重组载体载体tk1 HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体HB1 neor目的基因目的基因HB2染色体染色体DNAHB1染色体染色体DNAHB2染色体染色体DNA染色体染色体DNA染色体染色体DNA只有目的基因和只有目的基因和neor基因整合进去，基因整合进去，tk基因基因不会整合。

不会整合细胞在细胞在G418中存活中存活五、转染细胞的选择五、转染细胞的选择正正-负选择法：负选择法：1. 正选择（正选择（positive selection）：）：用用G418进行选择进行选择 没有整合进没有整合进neor基因的细胞都被杀死基因的细胞都被杀死2. 负选择（负选择（negative selection）：）：用用9-鸟嘌呤鸟嘌呤（（ganciclovir，，GCV）表达胸苷激酶（表达胸苷激酶（tk）的细胞都被杀死）的细胞都被杀死（（Tk能把能把GCV转化成有毒的化合物转化成有毒的化合物）。