[医药卫生]7核酸类药物分析.ppt

第七章 核酸类药物分析,,知识要点,1．掌握核酸类药物的概念，了解核酸类药物的分类 2．理解核酸类药物的主要的鉴别试验、杂质检查方法，掌握核酸类原料药的含量测定方法和计算 3．掌握典型的核酸类药物硫鸟嘌呤、肌苷、三磷酸腺苷二钠、三氮唑核苷、聚肌胞、免疫核糖核酸等的结构、性质、质量分析及含量测定方法第一节 核酸类药物概述,是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷，甚至碱基等一类药物的统称 按其作用特点可分为： (1)抗病毒剂 (2)抗肿瘤剂 (3)干扰素诱导剂 (4)免疫增强剂 (5)供能剂,依据核酸类药物及其衍生物的化学结构和组成成分4大类： （一）核酸碱基及其衍生物 （二）核苷及其衍生物 （三）核苷酸及其衍生物 （四） 多核苷酸类,第二节 分析、检测的方法,一、核酸类药物的鉴别试验 一般鉴别试验（化学基团反应） 紫外吸收法 薄层色谱法 高效液相色谱法 红外吸收光谱法,,定性,红外分光光度法IR,物质分子吸收波数位于4000-400cm-1范围的红外光而产生的吸收光谱称为红外吸收光谱 利用红外吸收光谱对物质进行分析的方法称红外分光光度法 红外吸收光谱是由分子的振动、转动能级引起的光谱特征性强，除了光学异构体及长链烷烃同系物外，几乎没有两种化合物具有完全相同的红外吸收光谱。

应用：药物鉴别、 [中国药典]对无效或低效晶型进行检查 试样的制备方法除另有规定外，用作鉴别时应按照药典委员会编订的《药品红外光谱集》收载的各光谱图所规定的制备方法制备红外光谱法广泛用于有机药物的定性和结构分析，在药物的鉴别试验中用的非常普遍 迄今为止，国家药典委员会已编排出版了3卷《药品红外光谱集》作为国家标准系列配套用书，广泛用于药品的鉴别检验，其中1995年出版了第1卷，收载了光栅型红外分光光度计绘制的药品红外光谱图共685幅2000年出版了第2卷，收载药品红外光谱208幅，并全部改成了傅里叶红外光谱仪绘制2005年出版第3卷，共收载药品红外光谱210幅（其中172个为新增品种，38个老品种进行了重新绘制）红外光谱仪,横坐标波数，纵坐标百分透过率 ，谷底表示吸收峰谱图解析的一般程序,一种是按光谱图中吸收峰强度顺序解析，即首先识别特征区的最强峰，然后是次强峰或较弱峰，它们分别属于何种基团，同时查对指纹区的相关峰加以验证，以初步推断试样物质的类别，最后详细地查对有关光谱资料来 确定其结构； 另一种是按基团顺序解析，即首先按C=O、O-H、C-O、C=C（包括芳环）、C≡N和—NO2等几个主要基团的顺序，采用肯定与否定的方法，判断试样光谱中这些主要基团的特征吸收峰存在与否，以获得分子结构的概貌，然后查对其细节，确定其结构。

注意：在解析过程中，要把注意力集中到主要基团的相关峰上，避免孤立解析各种官能团的吸收频率范围,,从第一区域到第四区域，4000cm-1到400cm-1各种官能团的特征吸收频率范围各种官能团的吸收频率范围,各种官能团的吸收频率范围,根据特征吸收的位置，判断可能存在的特征官能团,IR与UV的区别,IR UV 起源 分子振动能级伴随转动能级跃迁 分子外层价电子能级跃迁 适用 所有红外吸收的有机化合物 具n-π*跃迁有机化合物 具π-π*跃迁有机化合物 特征性 特征性强 简单、特征性不强 用途 鉴定化合物类别 定量 鉴定官能团 推测有机化合物共轭骨架 推测结构,,,通过应用先进的红外光谱快速检测方法和近红外无损伤探测技术（光纤探头） ，在笔记本电脑上录入被检药品的化学名、生产厂家等基本资料， 由药品快检人员使用近红外探测枪隔着铝箔包装，对抽检药品照射数秒钟，就能对有关药品进行简单检测，然后与被检药品基础信息库资料进行比对，从而快速辨别出药品的真假对于部分有特定对比模板的被检测药品，最短可以在3分钟内鉴别出真假。

近红外光纤枪,,二、核酸类药物的杂质检查,一般杂质检查 具体包括：具体包括氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、砷盐、水分、易炭化物、炽灼残渣、干燥失重等检查方法收录于药典附录中，杂质限度要求收录于药典正文检查项下 特殊杂质检查 特殊杂质指某一个或某一类核酸药物的生产或贮藏过程中引入的杂质，如巯嘌呤中的6-羟基嘌呤、氟胞嘧啶中的氟尿嘧啶、三磷酸腺苷二钠中的一磷酸腺苷钠和二磷酸腺苷二钠等、肌苷中的有关物质等特殊杂质 （思考：各用了什么方法？）,巯嘌呤中的6-羟基嘌呤,问题：薄层层析中硅胶板的规格分为：G ，H，GF254，HF254这些是根据什么分类的？ 答案：硅胶H“-不含粘合剂；“硅胶G“-含煅石膏粘合剂；“硅胶HF254“-含荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；“硅胶GF254“-既含煅石膏又含荧光剂. H-Hard；G-Glutinous；F-Fluorescent,,氟胞嘧啶中的氟尿嘧啶中用什么方法来检查特殊杂质限量？限量是多少？ 肌苷中的有关物质的检查用的是什么方法？原理是什么？,HPLC用于杂质检查的方法,内标法（加校正因子） 外标法 主成分自身对照法（加校正因子） 主成分自身对照法（无校正因子） 面积归一化法,内标物+ 杂质对照品 →校正因子,内标物+样品→杂质含量,,外标法,（3）加校正因子的主成分自身对照法,待测成份对照品+杂质对照品→ 计算校正因子,供试品→供试品溶液,供试品的稀释液→对照品溶液,测量供试品溶液色谱图上各杂质 的峰面积，分别乘以相应的校正因子 后与对照溶液主成分的峰面积比较， 依法计算各杂质含量,优点 准确度高,（4）不加校正因子主成分自身对照法,供试品→供试品溶液,供试品的稀释液→对照品溶液,测定供试品溶液中各杂质峰面积， 与对照溶液主成分峰面积比较，控制 杂质的量,缺点 检测波长处，各杂质和药物的 吸收强度可能有差异，准确度 差,优点 不需杂质对照品，可同时控制 各个杂质及其总量限度,（5）面积归一化法,取一定量供试品溶液进样，测定各杂质的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积占总峰面积的百分率，应符合规定。

优点 不需杂质对照品，简便易行,缺点 检测波长处，各杂质和药物 的吸收强度可能有差异，控制 杂质峰面积百分率不一定就是 杂质限量，准确度差,结论：根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致 HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度三、核酸类药物的含量测定方法,（一）滴定分析法 （二）紫外-可见分光光度法 （三）高效液相色谱法 （四）其他分析方法,色谱条件与系统适用性,色谱条件：色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的 规定常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶除另有规定外，柱温为室温， 检测器为紫外吸收检测器。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改 变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各 组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以适应具体品种并达 到系统适用性试验的要求一般色谱图约于20分钟内记录完毕2.系统适用性试验,按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调 整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和 拖尾因子 (1) 色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰高宽(Wh/2),按n=5.54(tR／Wh/2)２ 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使 理论板数达到要求如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使 理论板数达到要求。