HIV-1病毒的核酸异质性及准种特点的研究.pdf

1 3 ．H I V 一1 病毒的核酸异质性及准种特点的研究深朝I 市东湖医院( 5 1 8 0 2 0 )王辉陆坚徐六妹李丽雄王火生周伯平人类免疫缺陷病毒( H Ⅳ) 是一种R N A 病毒，需要R N A 依赖R N A 多聚酶进行复制由于R N A 聚合酶对复制的产物缺乏校正功能，因而导致R N A 产物常出现高频率的核昔酸替换，产生变异性复制体，这种变异的特点，表现为型，亚型和准种的特性其中准种特性因能引起免疫逃逸而倍受关注对于不同个体而言，宿主的免疫选择压力与H I V 基因变异的关系，目前罕见报道为了探讨I 型人类免疫缺陷病毒( H Ⅳ一1 ) 膜蛋白基因( e n v ) 的准种的存在情况与变异特点，我们对5 例艾滋病患者体内H I V一1 毒株共3 4 株克隆序列进行分析研究，现报道如下I 材料与方法1 1 血浆来源和I L N A 的分离5 例患者2 例为女性，3 例为男性，年龄在2 6 4 0 岁之间根据( 2 0 0 1 年中华人民共和国H I V ／A I D S 诊断标准》临床诊断为艾滋病患者临床检测血清抗一H I V 抗体均 阳性，C D 4 细胞在3 6 —8 9 个／姗3 之间，血浆病毒载量为1 35 0 0 —16 7 00 0 0 拷贝／m l 。

5 例患者均无应用抗逆转录病毒治疗史采集静脉血3 r n l ，E D T A 抗凝，4 小时内1 2 0 0 转／分离心2 0 分钟，分离血浆，采用德国R o c h e 公司的H i g hp u r ev i r a lR N A 试剂盒，严格按说明书分离患者血浆中的H I V —R N A 1 ．2 目的片段的扩增用R T —P C R ( 日本T a K a R a 公司O n eS t e pR N AP C R 试剂盒) 和n e s t e d —P C R对H I V —l e n v 基因g p l 6 0 部分进行扩增，扩增引物及其条件见表l ，最后得到3 3 6 b p 的片段表1 用于扩增e n v 基因部分片段的引物及反应条件1 ．3 克隆目的片段P C R 产物经l ％琼脂糖凝胶电泳后，与D N A M a r k e r 对照无误后，切下特异性扩增带，用德国Q i a g e n 公司的Q I A q u i c k G e l E x t r a c t i o n 试剂盒，按说明过柱纯化P C R 产物，将纯化好的P C R产物与日本T a I ( a R a 公司生产的p M D l 8 一T 载体在P C R 扩增仪上，1 6 ℃反应3 0 分钟完成连接反应。

将连 接好的质粒转入大肠杆菌D H S a 感受态细胞中，随机挑取阳性菌落，3 例标本分别挑取8 个克隆，其余2例分别挑取5 个克隆，共3 4 株，完成阳性克隆的鉴定1 ．4D N A 测序采用内侧正义引物为测序引物，以抽提纯化后的阳性克隆株为测序模板，美国P E公司的B i g D y eT e r m i n a t o rR e a c t i o n 试剂盒，按说明进行测序反应，反应产物经纯化后在美国A B I 公司的31 0 0 型基因分析仪上进行测序1 ．5 序列分析与数据处理测得序列经D N A S t a r 公司L a s e r g e n e9 9 软件的M e g A l i g n 模块，将序列进行校正后，采用C L A S T A LW 程序对所测序列进行同源排序，并计算其核营酸的同源性；用N e i 和c , o j o ．b o i l 的计算方法计算每个氨基酸位点的同义替换率( ( d s ) 与非同义替换率( d 1 1 ) 的比值；采用S P S S8 ．0对数据进行统计学分析 2 结果- - ——1 0 9 ·—- —-2 ．1H I V 准种检测结果5 例患者体内H I V 准种的检测结果分别为：患者l ( S Z 0 1 ) ：克隆株8 株，有2 株序列相同，准种株7 株占( 8 7 ．5 ％) ；患者2 ( S Z 0 2 ) ：克隆株8 株，有3 株序列相同，准种株6 株占( 7 5 ％) ；患者3 ( S Z 0 3 ) ：克隆株5 株，有2 株序列相同，准种株4 株占( 8 0 ％) ；患者4 ( S z 0 4 ) ：克隆株5 株，准种株5 株占( 1 0 0 ％) ；患者5 ( s z 0 5 ) ：克隆株8 株，有3 株序列相同，准种株6 株占( 7 5 ％) 。

同一患者体内H I V 准种株平均为8 3 ．5 ％2 ．2 克隆株核苷酸序列同源性分析与比较患者1 体内的7 株准种克隆株之闻的核苷酸同源性介于8 8 ％～9 9 ％之间，与来自其他不同患者的4 株克隆株之间的核苷酸同源性为7 5 ％，9 1 ％，各克隆株之间核苷酸序列同源性分析与比较详见表2 同一患者各克隆株的核酸序列排列图表2 相同与不同患者之间各克隆株核苷酸序列同源性分析( ％)S Z 0 1 一lS z o l 一2S Z 0 1 —3锄l 一4 锄l 一5 锄l 一6S z 0 1 —7嫩S 嬲S z 0 4S 脚8 9鼯9 08 88 9***9 59 69 89 59 69 2***2 ．3H I V 一1e l ' I V 基因c 2 ～2 3 区与v 3 区核苷酸变异频率及同义替换率( d s ) 月E 同义替换率( d 1 1 )值的比较为了分析C 2 一C 3 区与”区核苷酸的变异是否与选择压力有关，我们分别计算了c 2 c 3 区与V 3 区碱基变异频率及d s ／d n 比值，详见表3 从表3 中可见，V 3 区的碱基变异频率明显高于C 2 一c 3区( P 1 。

表3C 2 一{ 2 3 区与V 3 区碱基变异频率及d s ／d n 比值基因区序列数基因变异频率d s ／d n 比值‘与C 2 c 3 组比较P l 提示病毒的自身变异在C 2 一c 3 区变异中起主要作用，v 3 区序列的高度变异还要受到其功能性的限制1 4 ．艾滋病合并丙型肝炎的临床与治疗东南大学医学院附属南京市第二医院感染科( 2 1 0 0 0 3 ) 姚文虎赵伟赵红魏洪霞刘伟艾滋病病毒感染者艾滋病患者( H I V ／A I D S ) 合并肝脏损害非常多见，其合并肝脏损害的原因也是多样的，现将我院收治的艾滋病中合并丙型病毒性肝炎( 丙型肝炎) 的病例及其治疗报告如下 1 对象与方法1 ．1 病例选择2 0 0 1 年1 1 月至2 0 0 4 年1 2 月，我院共治疗H I - V ／A I D S5 2 例5 2 例中1 8 例合并感染丙型肝炎病毒( H C v ) ，其中3 例H I V ／H C V ／H B V 混合感染1 8 例中男1 3 例，女5 例，年龄1 3 4 8 岁，平均3 3 ．3 ±l O ．3 岁A D S1 6 例，H I V2 例1 ．2 感染途径1 8 例中经血传播1 5 例，其中血友病6 例，输( 供) 血6 例，静脉注射吸毒3 例；经性途径传播2例；传播途径不详l 例。

1 ．31 ．3 ．1 血常规：1 8 例入院时W B C ( 1 ．5 3 ．6 ) ×1 0 9 ／L ，淋巴细胞计数( O ．7 1 ．3 ) ×1 0 9 ／L o1 ．3 ．2 抗一H I V 检测：每例均经初筛( E L I S A 法) 和确认试验( W B 法，江苏省C D C 检测) 证实抗一H Ⅳ阳性1 ．3 ．3H I V —R N A 病毒载量：1 2 例检测了H I V —R N A 病毒载量( N A S B A 法，上海C D C 检测) ，8 0 0 0 0e o p i e s ／m l ～6 6 00 0 0c o p i e s ／m l ，平均2 4 ．8 ±1 8 ．5 万e o p i e s ／m l 1 ．3 ．4T 细胞弧群分类：1 8 例检测了T 细胞亚群，其中1 6 例A I D S ，C D 4 T 细胞均小于2 0 0 ／u l 为4 ／u 1 ．1 9 5 ／d ，平均8 I ．74 - 5 4 ．5 ／u l 2 例C I M T 细胞在正常范围者为H I V 感染者1 ．3 ．5 肝炎标志物检测：1 8 例抗～H C V 阳性( E L I S A 法) ，其中3 例H B V 同时阳性( 2 例H B s A g 、抗一H B c 阳性；l 例H B s A g 、H B e 鲰、抗一H B c 阳性) 。

3 例H C V —R N A ( P C R 法) > 5 ．0 ×1 0 2 1 ．3 ．6 肝功能检测：A L T ，3 例正常，余1 5 例为4 5 3 6 8 u ，平均8 7 ．8 ±3 7 ．4 u ，高于1 2 0 u 三例，分别为1 4 5 u 、1 5 8 u 、3 6 8 u ；胆红素，1 5 例正常，余3 例分别为2 5 ．5 t n n o l 、4 7 ．6 u n l o l 和5 1 ．2 u r n o l ；白蛋白，1 3 例正常，5 例降低，为3 4 ．1 9 、3 3 ．6 9 、3 2 ．7 9 、3 0 ．5 9 ；2 7 ．6 9 球蛋白，1 5 例止常，3 例增高，为3 4 ．5 9 、3 6 ．6 9 、3 8 ．2 9 0—ll l —。