氧化应激在氟骨症成骨细胞激活中的作用.pdf

氧化应激在氟骨症成骨细胞激活中的作用徐辉张文博王春艳井玲李广生( 吉林大学医学部地方病研究所，吉林长春1 3 0 0 2 1 )研究氧化应激在氟骨症成骨细胞激活中的作用 1 方法1 ．1 实验动物与处理因素：4 8 只W i s t a r 大鼠．按体重均匀分成4 组，每组1 2 只设立常食和低钙两大组大鼠饮用的自来水中加氟[ 每升水含有2 2 1m g氟化钠( N a F ) ，相当于含氟( F 一) 1 0 0m s ／L ] 设为高氟组，对照组饮用自来水( 每升水的N a F < 1m g ) 常食大组分为对照组和高氟组；低钙大组分为低钙组和低钙高氟组1 ．2 血清氧化应激指标的检测：大鼠J l } L 清脂质过氧化产物丙二醛( M D A ) 的测定用硫代巴比妥钠法；血清超氧化物歧化酶( S O D ) 检测用邻苯三酚自氧化法；血清谷胱甘肽过氧化物酶( G P X ) 的活性检测二硫双硝基苯甲酸( D T N B ) 法，碱性磷酸酶( A L P ) 活性的检测使用对一硝基苯二钠( P N P P ) 法，血清尿酸的检测用磷乌酸法1 ．3 大鼠骨组织总R N A 提取和P C R 检测：实验周期为1 2 周，每组取5 只大鼠一侧股骨。

无菌手术刀切除3m m 的带有干骺端和松质骨带宽的组织研磨成粉末状的骨干组织用2m lT r i z o l 试剂溶解提取总R N A 取总R N A 经引物o l i g o ( d T ) 1 8 在反转录酶作用下，在骨桥蛋白、骨钙蛋白、核心结合因子1和磷酸甘油醛脱氢酶( s l y c e r a l d e h y d e ．3 ．p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，G A P D H ) 引物介导下进行P C R 其中 G A P D H 作为内参取P C R 产物在进行2 ％琼脂糖凝胶电泳，所得条带的光密度使用T a n o nG I S 一9 0 0密度扫描仪和G I S I D 软件进行数据分析1 ．4 三维细胞的培养及处理因素：取成年W i s t a r大鼠2 只，按常规方法抽取鼠尾胶原用0 ．1 ％乙酸溶解和提取较纯的I 型胶原蛋白取8 倍体积的鼠尾胶原原液，1 倍体积的1 0 ×D M E M 培养基l 倍体积O S 一7 3 2 ( 人骨肉瘤细胞系) 细胞悬液在冰盒上无菌小瓶内迅速混匀，调p H 值在7 ．4 0 左右。

将混合液注入细胞培养板中置培养箱中3 7 ℃1 0 一·基础医学·2 0r a i n 使其凝固成为胶原凝胶，加5 ％D M E M 培养基．隔天换液待细胞逐渐伸展，血清浓度换成2 ％进行染氟处理时间分别为0 ．5 、1 、2 、4 和1 0d ，每个时间段分为对照组和0 ．1 、1 、2 、8 、1 6m g ／L 组5 个不同氟组对照组用基础培养基，每组设1 2 个孔1 ．5 细胞活性和氧化应激的检测：采用四甲基偶氮唑蓝( M Y r ) 法进行细胞活性的检测利用1 ％曲拉 通破碎细胞．细胞裂解液的M D A 水平和G P X 活性的检测方法与上面相同；A L P 、^ y 一谷氨酰转肽酶( G G T ) 的活性和蛋白含量的检测使用B e c k m a nC X 9 全自动生化分析仪进行⑥数据分析：数据以x ±s表示，使用S P S S l l ．5 统计软件进行统计分析，组间比较采用L S D 和D U N C A N 法进行显著性检验，检验水准仅= 0 ．0 5 2 结果2 ．1 投氟不同时间大鼠血清A L P 活性的变化：投氟1 、1 2 周常食投氟组大鼠的A L P 酶活性较对照组明显增高：饲低钙偏食大鼠血清A L P 活性有不同程度的提高：而且饲偏食饲料的投氟组大鼠的A L P 活性在4 、8 和1 2 周后较之相应时段的对照组显著升高。

总体上可以看出A L P 的酶活性与投氟时间和钙营养水平有着一定的联系，低钙可明显加强过量氟刺激的A I J P 酶活性2 ．2 投氟不同时间大鼠血清氧化应激态的变化：常食投氟组大鼠的血清M D A 水平在投氟l 、4 周后比对照组明显高；偏食组大鼠血清M D A 水平亦当在4周后较对照组明显升高；而低钙加氟组大鼠血清M D A 含量在4 、1 2 周后较之对照组明显增多总体上可以看出．投氟早期刺激机体脂质过氧化水平明显升高．随着低钙加氟时间的延长到1 2 周后，大鼠体内的脂质过氧化水平明显增强各组大鼠的不同时间段血清G P X 的活性的变化：在各时间段常食投氟组大鼠血清G P X 活性较之相应对照组比较变化不明显：与之不同的是而钙营养缺乏的大鼠的G P X酶活性却是在l 、4 和8 周后较之相应对照组显著下降；而低钙加氟组大鼠血清G P X 活性在1 、4 周后较之偏食对照组显著升高，持续第8 周后，酶活性较之常食对照组显著降低，但高于低钙对照组，实验到达第1 2 周后，该组G P X 的酶活性为四组中最低从总体上看，钙营养缺乏能够明显降低G P X 的酶活性，两种处理因素同时施加给大鼠。

在早期该酶活性刺激升高，随着投氟时间的延长酶活性逐渐降低各组大鼠的不同时间段血清S O D 的酶活性变化：偏食加氟大鼠的S O D 酶活性在投氟l 周后较之常食对照组和偏食对照组明显升高；在投氟第8 周后，低钙组和低钙加氟组大鼠血清S O D 酶活性却是显著降低的总体上看，各组S O D 酶活性变化没有显著性规律各组大鼠的不同时间段血清尿酸水平的变化：在饮水投氟1 周后常食组大鼠的血清尿酸水平显著升高，随着投氟时间的延长，血清尿酸的水平表现为先高后低：偏食对照组各时间组大鼠血清的尿酸在l 、4 和8 周后变化不明显；而低钙加氟组的尿酸水平变化与常食加氟组变化趋势类似，即在实验早期尿酸水平显著升高，到后期尿酸水平明显降低总体表现为尿酸水平的变化与氟中毒的时间有着密切的关系，而与钙营养水平关系不大2 ．3 投氟不同时间大鼠血清钙( C a 2 + ) 浓度变化：常食投氟组大鼠的血清C a 2 + 在1 周后明显提高．而低钙加氟组大鼠血钙明显降低随着时间的延长，常食投氟组、低钙对照组和低钙加氟组大鼠的血清钙逐渐下降，尤其在实验周期达到1 2 周后，低钙对照组和低钙加氟组大鼠的血清钙较之常食对照组显著下降。

总体上可以看出，氟作朋时间的延长可降低血清的钙水平，而加氟不能进一步降低偏食造成的血钙降低2 ．4 投氟不同时间大鼠骨组织O P N 、O C N 和C b f a l的表达：R T —P C R 合成的特定O P N 、O C N 、C b f a l 和G A P D H 的e D N A 片段经琼脂糖凝胶电泳．R T —P C R产物电泳图与该基因在基因库( 美国国立图书馆G e n e b a n k ) 所检索到片段碱基数吻合骨组织P C R产物半定量分析结果：偏食对照组大鼠骨组织的O P N 和O C N 的m R N A 表达水平明显上调．而且．偏食加氟组大鼠骨组织的O P N 、O C N 、C b f a l 的m R N A表达水平较之常食对照组表达显著增强．与常食加氟组比较，偏食加氟组大鼠骨组织的O P N 、C b f a l 表达明显提高总体上可以看出在钙营养缺乏或同时饮水投氟明显刺激骨组织成骨功能相关基因的表达2 ．5 染氟不同时间三维培养O S 一7 3 2 细胞活性变化：培养液中含F - 0 ．1m s ／L 处理O S 一7 3 2 细胞1d·8 5 ·到1 0d 时细胞活性均较之相应的对照组明显增强；含F 一1m g ／L 的培养液培养的细胞活性在4 、1 0d时比对照组明显高；含P2m g ／L 的培养液培养的细胞活性在4d 时比对照组明显高；随着氟浓度的提高，含P8m g ／L 、1 6m g ／L 的培养液培养的细胞活性在2 、4d 时显著高于对照组；而当氟处理时间达到1 0d 时．高剂量的氟却明显抑制了该细胞活性。

总体上看，极低浓度、低浓度的氟能够刺激成骨细胞样细胞活性，而中、高剂量的氟处理在短期内刺激细胞活性．随着时间的延长．确是抑制细胞活性2 ．6 染氟不同时间三维培养O S 一7 3 2 细胞A L P 活性变化：在氟处理0 ．5d 的时间里含F 一0 ．1 、2 和8m s ／L 的培养液培养的细胞A I J P 活性较之对照组明显升高；随着染氟时间至2d ，可见到低浓度的氟促进细胞A I J P 活性的提高染氟时间达到1 0d 时，2 、8m g ／L 处理的细胞A L P 活性明显下降，而含P1 6m g ／L 处理的细胞A L P 活性却显著提高总体上可以看出低浓度的氟在短期内能够刺激细胞A I J P 活性．而长时间暴露于中剂量的氟抑制细胞该酶活性然而长时间暴露于高剂量的氟却刺激细胞A L P活性 2 ．7 染氟不同时间三维培养O S 一7 3 2 细胞氧化应激水平的变化：①染氟不同时间三维培养O S 一7 3 2细胞M D A 水平变化：染氟0 ．5d 时，含r0 ．1 、2 和8m g ／L 细胞的M D A 水平比对照组明显增多；而染氟1d 时．含r1 、2 和8m g ／L 细胞的M D A 水平比对照组显著增多；而染氟到2 d 时，含F 一1 、8m g ／L 细胞的M D A 水平比对照组显著增多；而当染氟达到1 0d 时，细胞的M D A 水平却在0 ．1m 以明显增多。

总体上看在染氟早期，既从极低水平氟到高水平氟的不同程度的激起细胞脂质过氧化水平，随着时间的延长细胞脂质过氧化产物M D A 水平在中、高剂量氟处理组除个别组外，M D A 水平不同程度的增多②染氟不同时间三维培养O S 一7 3 2 细胞G P X活性变化：染氟0 ．5d 时，含r2 、8 和1 6m g ／L 细胞的G P X 活性比对照组明显增强：而染氟1d 时，含 P2m g ／L 组细胞的G P X 活性比对照组显著高，1 6m g ／L 组细胞的G P X 活性比对照组明显低；在染氟4d 时含F L8m g ／L 组细胞的G P X 活性亦是显著提高，染氟1 0d 时，细胞的G P X 活性在低剂量组升高，而高剂量组该酶活性下降，具有一定的剂量依赖性特征③染氟不同时间三维培养O S - 7 3 2 细胞G G T 活性变化：染氟ld 时．含PO ．1 、1 、2 、8 和1 6m r , ／L 细胞的G G T 活性比对照组明显增强；染氟2d时含P2m s ／L 组细胞的G G T 活性比对照组明显高总体上可以看出染氟早期可以明显刺激细胞G G T 酶活性的提高，随着时间的延长。

G G T 的酶活性在不同剂量氟作用下变化并不明显 3 结论3 ．1 通过对氟中毒大鼠不同时期血清钙水平、A L P活性和氧化应激水平的分析．发现氟作用时间的延长可降低血清的钙水平．而加氟不能进一步降低低钙营养造成的血钙降低比较之下A L P 的酶活性在投氟早期和后期均有显著提高．且该酶活性和钙营养水平有着一定的联系．低钙可明显加强过量氟刺激A L P 酶活性3 ．2 利用R T —P C R 法观察到与成骨功能密切相关的O P N 、O C N 和C b f a l 的基因表达情况可以看出在钙营养缺乏或同时饮水投氟明显刺激骨组织成骨相关基因的表达，也反映出低钙营养可明显加重氟的刺激成骨作用3 ．3 在钙营养充分的条件下．伴随着新骨形成增多和骨样组织堆积可以观察到脂质过氧化物水平不同程度的升高，抗氧化酶变化不显著，而机体内重要的抗氧化因子之一的尿酸却是先升后降，代偿体内氧化应激态；而钙营养缺乏投氟造成了大鼠骨组织典型的成骨活跃状态及成骨细胞和破骨细胞增生的高骨转换态伴随着m 清脂质过氧化物增多、G P X 酶活性的下降和尿酸水平的降低，表明机体内氧化应激态的增强都反映出氧化应激在氟骨症发生、发展中占有一定地位。