急性运动性轴索型神经病动物模型的建立.pdf

河北医科大学硕士学位论文急性运动性轴索型神经病动物模型的建立姓名：阎丽娜申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：郭力2003.3.1中文摘要急性运动性轴索型神经病动物模型的建立摘要目的：急性运动性轴索型神经病( a c u t em o t o ra x o n a ln e u r o p a t h y , A M A N ) 是格林一巴利综合征( G u i l l a i n ．B a r r es y n d r o m e ，G B S ) 的一种亚型，在我国华北地区发病率较高其临床特点是运动功能受损明显，而感觉功能大多正常，一般病情重，多有呼吸肌受累，2 4 4 8 小时内迅速四肢瘫，肌萎缩出现早，病残率高，预后差病理改变为前根和周围运动神经轴索变性，轻度脱髓鞘，病灶中炎性细胞浸润少见目前A M A N 的病因及发病机制尚未确切阐明A M A N 与急性炎性脱髓鞘性多发性神经病f a c u t ei n f l a m m a t o r yd e m y e l i n a t i n gp o l y n e u r o p a t h y , A I D P ) 不同，因为A I D P 已具有公认的动物模型，即实验性自身免疫性神经病( e x p e r i m e n t a la u t o i m m u n en e u r o p a t h y , E A N ) ，可用牛P 2 蛋白免疫L e w i s 大鼠诱发，其病理及临床所见与A I D P 相似，且病残率高可重复性强。

而关于A M A N 动物模型的研究有很多，其中本实验室曾用空肠弯曲菌( C a m p y l o b a c t e rj e j u n i ， c i ) 免疫鸡使部分鸡发生类似A M A N 病人的瘫痪，这个模型在国际上引起重视但是上述模型发病率较低，用于进一步研究的实用价值有限，这促使我们进一步研究建立发病率高且可重复性强的A M A N 动物模型的方法神经节苷脂是一族酸性糖脂，它们由脂质与碳水化合物两大部分组成，是哺乳动物神经细胞膜的主要成分中文摘要之一，在脑内G M l ，G D I a , G D l b ，G T l b 这四种神经节苷脂含量丰富，其中以G M l 最多，神经系统外含量甚少大量文献报道1 0 - 4 2 ％的G B S 病人血清中含有抗神经节苷脂抗体，尤其是抗．G M l 抗体有作者用G M l 抗体阳 性的多发性运动性神经病( m u l t i f o c a lm o t o rn e u r o p a t h y , M M N ) 患者血清注入鼠的坐骨神经，引发了传导阻滞并发现在郎飞结处有免疫球蛋白沉积；另外也有用G D l b 免疫日本大耳白兔引发感觉性轴索型神经病的报道。

这使我们认识到神经节苷脂及其抗体在G B S发病中可能起重要作用因此本研究探讨应用神经节苷脂免疫实验动物建立A M A N 动物模型的方法材料与方法：选择曰本大耳白兔作为实验动物，应用牛脑神经节苷脂( B o v i n eB r a i nG a n g l i o s i d e s B B G ) 或神经节苷脂G M l 作为免疫原，与K e y h o l eL i m p e t sH e m o c y a n i n ( K L H ) ，弗氏完全佐剂( F r e u n d ’SC o m p l e t eA d j u v a n t ，F C A ) 一起于背部皮下及腹腔内两个部位注射以免疫动物，每3 周1 次，直至动物出现瘫痪或首次免疫后6 个月仍无任何临床症状在动物出现肢体无力后，根据其病情严重程度，予当天或发病后2 0 天内将其处死，原则是在动物自然死亡前取材将符合上述条件的实验动物经心脏取血处死，迅速取其左右坐骨神经，左右臂丛神经及部分脊髓的前后根，经修整后置入4 ％多聚甲醛固定液中固定2 4 小时后，可取出经磷酸盐缓冲液( P B S ，P H 7 ．4 ) 冲洗，浸入0 ．5 ％锇酸中振荡染色1 ．5 小时后，再用P B S ( P H 7 ．4 ) 冲洗，之后经3 3 ％，6 6 ％，1 0 0 ％甘油系列脱水后可保存于1 0 0 ％甘油中以备分离神中文摘要经单丝，观察神经变性情况。

另外，在实验过程中，每周经耳静脉取血1 次，放入E D T A 抗凝管，轻轻摇匀经离心可得血浆，将其分装，置．2 5 ℃保存本实验应用酶联免疫吸附实验( E L I S A ) 检测血浆中抗．G M lI g G 抗体首先将抗原G M l 包被于9 6 孔酶标板上( G M l2 5 0n g ／1 0 0“l 无水乙醇) ，在室温下蒸发干燥，之后每孔加2 0 0u11 ％牛血清白蛋白．磷酸盐缓冲液( 1 ％B S A ．P B S ，P H7 ．4 ) ，室温孵育2 小时，P B S 洗板5 次，加1 0 0pl 待测血浆( 用1 ％B S A ．P B S 以l ：5 0 0 稀释，并行两孔) ，置4 “ C 过夜P B S 洗板5 次，空于后加H R P 标记的羊抗兔I g G 作为 二抗( 以I ％B S A ．P B Sl ：2 0 0 0 稀释) ，每孔1 0 0 u l ，室温孵育2 小时P B S 洗板5 次，加底物( 1 0 m l 基质液中含4 m g 邻苯二胺和5pl3 0 ％H 2 0 2 ) 1 0 0 ul 作用3 0 分钟后终止反应在4 9 2 n m 处用酶标仪( a n t h o sl a b t e c2 0 1 0 )测吸光度A 值。

并行两孔A 值的均值为最后实测值1 ％B S A ．P B S 做空白对照如果空白对照A 值> O ．2 ，重复实验血浆样品孔O D 值减去空白对照A 值后／> 0 ．1者为阳性，差值 0 ．2 ．r e p e a t e dt h et e s t ．Ar e a c t i o nw i t ha nAv a l u eo fm o r et h a nO ．1w a sc o n s i d e r e dp o s i t i v e ．W h e nt h ed i f f i r e n c e O ．2 ，则重复实验血浆样品孔A 值减去空白对照A 值后／> 0 ．1 者为阳性，差值譬眦uI≥冀砻昂≥一嚅口暑pI哥呐昌一一-拿oJoIllko晴呐Qg鼍墨墨芒oqog∞a一，P2Isonoi事乌囊曲∞_等岫∞暑Il高盘啦善∞∞Q{萋pIl暑嚣uI§莒iN‘sqmII苫皇善JosqIII!一puIq善Jo∞嚣薏誊暑uI§膏寻uuo口=o一3pn磊一瘩IoI菩蜃趸II弓簟韭z z z zzz}Iz zzf嚣一一_景兰罱∞}高昌葛暑争l 萋喜量趸翼i萝囊} {喜溪藿l{l{蓦圣霉g兰要至兰f：。

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舞一事口盘jjuoul鲁D嘎．I铀o∞一A量Bs时III器IdIIIsD一勺oo一_II再一暑告j，．oN2 j 兽皿研究论文参考文献1CYL i ，PX u e ，WQT i a n ，e ta 1 ．E x p e r i m e n t a lC a m p y l o b a c t e rj e j u n ii n f e c t i o ni nt h ec h i c k e n ：a na n i m a lm o d e lo fa x o n a lG u i l l a i n —B a r r es y n d r o m e ．JN e o r o s u r g ，P s y c h i a t r y19 9 6 ；61 ：2 7 9 ～2 8 4 ．2Y u k iN ，似( iT ，I n a g a k iF ，e ta 1 ．Ab a c t e r i u ml i p o p o l y s a c c h a r i d et h a te l i c i t sG u i l l a i n - B a r r es y n d r o mh a saG M Ig a n g l i o s i d e - l i k es t r u c t u r e ．JE x pM e d1 9 9 3 ；1 7 8 ：1 7 7 1 ～1 7 7 5 ．3A s p i n a l lG D ，M c D o n a l dA G ，P a n gH ，e t a l ．L i p o p o l y s a c c h a r i d eo fC a m p y l o b a c t e rj e j u n is e r o t y p e0 ：1 9 ：s t r u c t u r e sa n dt w ob a c t e r i a li s o l a t e sf r o mp a t i e n t sw i t ht h eG u i l l a i nB a r r es y n d r o m e ．B i o c h e m i s t r y1 9 9 4 ；3 3 ：2 4 1 ～2 4 9 ．4A r a s a k iK ，K u s u n o k iS ，K u d oK ，e ra 1 ．A c u t ec o n d u c t i o nb l o c ki nv i t r of o l l o w i n ge x p o s u r et oa n t i g a n g l i o s i d e s e r a ．M u s c l e。