高效液相色谱仪及固定相流动相.ppt

仪器分析课程讲义第四节 高效液相色谱仪目录目录高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统6.2 高效液相色谱仪一、输液系统1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性， 容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um 滤膜过滤 2．脱气装置作用：脱去流动相中的溶解气体 (1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)真空脱气法(on—1ine degasser) 3 3、、 高压输液泵高压输液泵输送流动相输送流动相压力压力：：150150～～350×10350×105 5PaPa 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到 色谱系统输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为恒压泵恒压泵、、恒流泵恒流泵两类两类1 1）往复式柱塞泵）往复式柱塞泵：： 恒流恒流 泵泵；； 易于更换溶剂，适用于梯易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。

以加一阻尼器抑制脉冲2 2）气动放大泵：）气动放大泵： 恒压泵恒压泵 液缸体积大，更换流动相液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱不方便，不便于梯度洗脱 ，， 无脉冲、稳定流量的输无脉冲、稳定流量的输 出出, ,现多用于装柱现多用于装柱b.b. 高压定量进样阀：高压定量进样阀：（六（六 通阀进样装置）通阀进样装置） 优点：进样准确，重现优点：进样准确，重现 性好，适于定量分析性好，适于定量分析b.b. c. c.自动进样器：自动进样器：计算机控计算机控 制，适合大量进样制，适合大量进样二、进样装置二、进样装置a. a. 停留进样装置：停留进样装置： 缺点：不能承受高压，须停流进样；缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间无法取得精确的保留时间三、高效分离柱三、高效分离柱色谱柱是实现分离的核心部件发展趋发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效势是减小填料粒度和柱径以提高柱效常规液相色谱柱常规液相色谱柱 1 1～～6 6 mmmm，，1010～～50 cm50 cm 微孔填充柱微孔填充柱 0.5-1m0.5-1mmm 毛毛细细细细管柱管柱 30-50µm30-50µm装柱方法：有干法和湿法，按粒度装柱方法：有干法和湿法，按粒度2020μmμm 划分。

划分 柱温控制下列几种情况需要控制柱温：n法定标准分析方法中，要求保留时间具 有再现性；n必须通过改变柱温来提高分离效率；n对高分子化合物或黏度大的样品；n对一些具有生物活性的生物分子；n对一些组成复杂的样品，使用二维色谱 技术四、液相色谱检测器四、液相色谱检测器1. 1.紫外检测器紫外检测器: : 应用最广，对大部分有机化合应用最广，对大部分有机化合物有响应物有响应作用原理：作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律系遵守比尔定律特点：特点：灵敏度高，可达灵敏度高，可达1010-9-9g.mLg.mL-1-1；；线性范围高；线性范围高； 可用梯度洗脱；可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样；不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）2.2. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器紫外可见光度检测紫外可见光度检测 器的重要进展；器的重要进展； 10211021个二极管阵列个二极管阵列 ，各检测某一特定，各检测某一特定 波长，无需停流扫波长，无需停流扫 描而观察色谱柱流描而观察色谱柱流 出物的各个瞬间的出物的各个瞬间的 动态光谱吸收图动态光谱吸收图光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器3. 3. 差示折光检测器（差示折光检测器（differential refractive differential refractive index detectorindex detector））除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中溶液的折光可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。

差值与浓度呈正比；指数差值差值与浓度呈正比；特点：特点：通用型检测器通用型检测器 ; ; 灵敏度低（灵敏度低（1010-7-7g.mLg.mL-1-1）），不能用于痕量分，不能用于痕量分析析; ;对温度敏感，要求使用温度恒定对温度敏感，要求使用温度恒定; ;对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱 许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发受紫外光激发 后能够辐射出荧光后能够辐射出荧光4. 4. 荧光检测器（荧光检测器（fluorescence detectorfluorescence detector））高灵敏度高灵敏度( (比紫外检测器高两个数量级，达比紫外检测器高两个数量级，达 1010-11-11g.mlg.ml-1-1) )高选择性高选择性; ; 线性范围窄；线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；物质；广泛应用于生物化工、制药、食品和环境广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中监测中. .5. 5. 电导检测器（电导检测器（electrical conductivity electrical conductivity detectordetector））属属电化学检测器电化学检测器，是离子色谱法中应用最，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器为广泛的检测器 作用原理作用原理：根据物质在某些介质中电离后：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。

量五、液相色谱法固定相1.1.固定相的形状固定相的形状（（1 1）全多孔型）全多孔型最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体孔球体 100 100μ μmm的大颗粒，表面涂渍固定液的大颗粒，表面涂渍固定液传质速度慢，柱效低传质速度慢，柱效低现采用现采用1010μ μmm以下的小颗粒以下的小颗粒 2 2）表面多孔型）表面多孔型( (薄壳型微珠薄壳型微珠) ) 30 30～～4040μ μmm的玻璃微球，表面附着一的玻璃微球，表面附着一 层厚度为层厚度为1 1 ～～ 2 2μ μmm的多孔硅胶的多孔硅胶表面积小，传质速度快，但柱容量低；表面积小，传质速度快，但柱容量低；2.2.液液- -固吸附固定相固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合 物包裹固定相 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；3.3.液液- -液色谱固定相液色谱固定相n惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子硅胶，无机氧化物、高分子 聚合物、脲醛树脂等，多为聚合物、脲醛树脂等，多为3—10um3—10um的全的全 多孔微球多孔微球。

n固定液：正相： 氰基柱、胺基柱等反相 : 烷基柱、苯基柱 4. 4. 化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相: : 目前应用最广、性能最佳的固定目前应用最广、性能最佳的固定相，一般用硅胶作为基体相，一般用硅胶作为基体a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： ≡ ≡SiSi——OO——C Cb. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：≡ ≡SiSi——OO——SiSi —— C C c. c. 硅碳键型：硅碳键型： ≡ ≡SiSi——C Cd. d. 硅氮键型：硅氮键型： ≡ ≡SiSi——N N化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（（1 1）传质快）传质快，表面无深凹陷，表面无深凹陷; ; （（2 2））寿命长寿命长，， 无固定液流失，耐流动相冲无固定液流失，耐流动相冲击；击； （（3 3）选择性好）选择性好，可键合不同官能团，可键合不同官能团 ；；（（4 4）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；六、液相色谱法流动相1.1.流动相特性流动相特性2.2.（（1 1）流动相的种类、配比可显著改变组）流动相的种类、配比可显著改变组 分分离状况；分分离状况；3.3.（（2 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相）亲水性固定液常采用疏水性流动相 ，， 称为正相液液色谱法称为正相液液色谱法; ;4.4.（（3 3）流动相的极性大于固定液的极性，）流动相的极性大于固定液的极性， 则称为反相液液色谱则称为反相液液色谱 。

组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 2. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：：单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分按极性分：：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 按使用方式分按使用方式分：：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮水、酰胺、腈、醇、酮 、酯、醚、烃类、酯、醚、烃类, , etc.etc.流动相可分为：流动相可分为：底剂底剂及及洗脱剂洗脱剂 底剂：底剂：决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；洗脱剂：洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用有选择性的分离作用3. 3. 流动相的选择流动相的选择采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间正相液正相液- -液分配分离（液固色谱极性固定相）液分配分离（液固色谱极性固定相）：：底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等，洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。

酮、醇等反相色谱（液固色谱非极性固定相）反相色谱（液固色谱非极性固定相）：：底剂：底剂： 水洗脱剂：洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂有机溶剂作为极性调节剂4 4 梯度洗脱梯度洗脱n n梯度洗脱梯度洗脱，与气相色谱中的，与气相色谱中的程序升温程序升温一样一样 ，可极大地改善分离效果，可极大地改善分离效果n n在分离过程中按照一定的程序连续改变载在分离过程中按照一定的程序连续改变载 液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的 变化来改变被分离组分的分离因素变化来改变被分离组分的分离因素通过梯度洗脱，可缩短分离时间通过梯度洗脱，可缩短分离时间 、提高分辨能力、改善峰形，还、提高分辨能力、改善峰形，还 可提高分析精度可提高分析精度n溶剂的组成在15min内，从10％（V/V） CH3CN-H2O随时间改变至50％CH3CN-H2O 梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度: 两台高压泵两台高压泵 ，将两种不同极性的溶，将两种不同极性的溶 剂按一定的比例送入梯剂按一定的比例送入梯 度混合室，混合后进入度混合室，混合后进入 色谱柱内梯度: 一台高压泵一台高压泵, , 通过比例调节阀通过比例调节阀, ,将两将两 种或多种不同极性的溶种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。

压泵中混合 讨论1用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容。