微生物检测与鉴定.doc

食品微生物检测内容以及新技术的运用摘要：食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全问题是关系到人身健康、经济发展和社会稳定 的重大问题影响食品安全的因素有很多种，但是最棘手的食品安全问题仍然是微生物造成的食源性污染 为了更好的开展食品微生物检验与调查工作，提高食品的卫生质量，保证消费者饮食安全，本文对微生物 的检测内容以及新技术在微生物检测中的应用做出了详细的介绍通过食品微生物检验新方法的分析，指 出食品微生物检验技术将向高效率、高标准、高精度和高灵敏度的方向发展关键词：食品微生物；微生物的检测；新技术的应用Content and application of newtechnology in food microbiology testingABSTRACT： Food is the material basis for human survival and development, and food safety is a major issue related to human health, economic development and social stability. There are many factors affecting the safety of food. There are many factors that affect food safety, but the most difficult food safety problem is still the food pollution caused by microorganisins contamination. In order to carry out food microbiological examination and investigation work better, to improve the hygienic quality of food and to ensure food safety for consumers,We make the detailed introductionon of microbial detection and the new technology application in the detection of microorganisms . Based on the analysis of the new method of food microbiological examination, it is pointed out that the food microbe inspection technology will develop to the direction of high efficiency, high standard, high precision and high sensitivity.Key words： Food microbiology, microbial detection, application of new technology1前言随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题逐渐成为各国政府和公众关注的焦点问 题。

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全问题是关系到人身健康、经济发展 和社会稳定的重大问题食品微生物检验是评价食品卫生质量、保证食品安全、预防和控制 食源性疾病的重要手段之一食品微生物检验工作对评价食品卫生质量，保证消费者饮食卫 生有着极为重要的作用，并且研究灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术 和方法[1],建立和完善食品安全微生物检测技术和体系迫在眉睫2食品微生物污染已知食品污染的微生物有多种，主要分为两类：一类为致病菌和条件致病菌，即病原微生物，病畜、禽肉可能带有各种病原菌，如沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌和炭疽杆菌，它们不仅使食品腐败变质，而且在一定的条 件下可以以食品为媒介引起人类感染疾病或食物中型［2］；另一类为非致病菌，即腐生微生 物，它们虽对人畜无致病作用，但可以在食品中生长繁殖，如细菌、酵母、霉菌往往导致食 品出现特异性的色、味、形，并与其相对致病性有关食品中的非致病菌是评价食品卫生质 量的重要指标，也是研究食品腐败变质原因、过程和控制方法的主要对象1.1常见食品微生物自然界中已知的细菌种类有很多，不是所有的自然界中的细菌都是食品细菌，食品中所 存在的细菌仅仅是自然界已知细菌的一小部分。

在食品中常见的细菌称为食品细菌根据食品原料的来源不同以及周围环境的卫生状况，以下几种细菌是食品中常见的［3］：（1） 微球菌属和葡荷球属：革兰氏阳性菌，嗜中温，营养要求较低在动物性食品上 多见，有的能使食品变色2） 假单胞菌属：革兰氏阴性无芽胞杆菌，需氧，嗜冷，PH5.0下生长，是典型的腐 败细菌，在肉、鱼等动物食品及蔬菜中均易生长繁殖3） 芽泡杆菌属和芽泡梭菌属：分布较广泛，尤其多见于肉和鱼嗜中温菌者为多， 是罐头食品中常见的腐败菌4） 弧菌属与黄杆菌属：均为革兰氏阴性兼性厌氧菌，主要来自海水或淡水，在低温 和5%食盐中均可生长，故在鱼类等水产食品中多见5） 肠杆菌科各属：除志贺氏菌属及沙门氏菌属外，皆为常见的腐败菌革兰氏阴性, 需氧及兼性厌氧，嗜中温杆菌，多见于水产品等动物性食品中6） 乳杆菌属：革兰氏阳性杆菌，厌氧或微需氧，在乳品中多见，可使乳品产酸变质7） 嗜盐杆菌属与嗜盐球菌属：革兰氏阴性需氧菌、嗜盐，在12%食盐甚至更高浓度 的食盐中均可生长，多见于咸鱼2食品微生物检验的内容2.1食品污染程度指示菌的检验2.L1细菌总数细菌总数又称菌落总数，是判断食品及生活饮用水被污染程度的指标。

所谓细菌总数是 指食品及生活饮用水检样经过处理，在一定条件下经过培养后，所得lg或1成检样中所含 细菌菌落个数这一数据可以为在对被检样进行卫生学评价时提供依据2.1.2大肠菌群①大肠菌群的概念大肠菌群系指一群在37C培养24小时后能发酵乳糖、产配、产气、需氧或兼性厌氧的 革兰氏染色阴性无芽泡杆菌该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标菌评价生 活饮用水及食品的卫生质量②大肠菌群数C大肠菌群数在食品及水中有不同的含义食品中的大肠菌群数是以每100ml (g)样本 中，大肠菌群数的最近似数(M、P、N)表示［4］水中的大肠菌群数是指1000ml被检样品 中所发现的大肠菌群数2.2食品中致病菌的检测在GB4798-94食品卫生检验方法中，对某些微生物的数量己明确规定，除要检测食品 污染程度指示菌，如菌落总数、大肠菌群(MPN)的测定外，还有致病菌如金黄色葡萄球 菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌都需菌数计算有人研究，志贺氏菌属传染剂量在20()7 10,000个范围内［5］；副溶血性弧菌神奈川阳性株使人发生食物中毒的活菌数，少数情况下 约10万，超过1,000万时，则半数以上发病；产气荚膜杆菌在引起人们食物中毒的食物中 含量均超过106/g则引起食物中毒。

从上述举例说明，诊断食物中毒仅作定性试验是不够的, 还需对致病菌定量检验笔者认为，随着科技发展，各种致病菌的定量检验必将全面开展 食品微生物检验工作者必须不断摸索、积累，致病菌的定量检验，使其他致病菌的定量检验 早日开展3新技术在食品微生物检测中的运用随着经济的发展以及人类对食品质量与安全要求的日益严格，对食品微生物检测技术也 提出了更高的要求近年来，许多快速检测方法，如PCR技术、基因芯片技术、ATP生物 发光技术等，以其简便、快速、高通量、高灵敏度等特点，在食品质量与安全控制领域得以 广泛研究与应用3.1 PCR技术PCR(Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应，是1985年诞生的一项DNA体 外快速扩增技术，数小时内可使目的基因片段扩增数百万倍PCR技术因具有简便、快速、 敏感性高和特异性强的优点，现已广泛应用于食品微生物的快速检测，尤其适用于突发食品 安全事件、时间要求紧迫的微生物检测工作，以及培养困难或常规方法不易检测的微生物谭炳乾等对GeneBank中单核细胞增生李斯特菌hlyA基因全序列进行比较分析［6］,选 择特异、保守的区域，设计引物，建立了单核细胞增生李斯特菌的PCR检测法。

Delibato 等选取沙门菌的ttrRSBCA基因为靶基因设计引物和探针［7］,并用这种方法对110株细菌和 175个肉样进行检测分析，检测特异性为100%随着PCR技术的不断发展，现已衍生出许多优良的PCR技术，如实时定量PCR、荧光定 量PCR、多重PCR等3.2基因芯片技术基因芯片，乂称DNA微阵列，即在固相支持物上原位合成寡核昔酸或者直接将大量预 先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固定于支持物表面，然后与标记的样品杂交， 再通过激光共聚焦荧光检测系统等对杂交信号进行检测分析，从而实现对生物样品快速、并 行、高效检测基因芯片技术引入微生物检测领域为建立快捷高效的检测方法提供了技术平 台，用于食品、水质中常见细菌/霉菌检测的基因芯片已经问世［8］Ammor等设计了包含7 大类抗生素抗性基因的300个寡聚核昔酸探针的基因芯片［9］,用于鉴定乳酸菌和双歧杆菌 固有的和获得性的抗生素抗性3.3生物传感器生物传感器是以生物化学和传感技术为基础，用酶、抗体、细胞等作为识别元件，与信 号转换器和电子测量仪共同构成的分析工具样品通过扩散作用进入识别元件，经分子识别, 与识别元件发生特异性结合，产生生物学信号，再通过信号转换器将其转化为光信号或电信 号，经仪表放大和输出，即达到检测目的。

Zhang 等设计了 Chro—prfA、Chro—invA> Chro —toxR 和 Chro—ompW 探针［10］,并优化检 测条件，实现了对单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测, 与传统检测方法及PCR检测方法相比，该方法具有度好的检测符合性生物传感器具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行 快速连续监测等诸多优点未来生物传感器的发展趋势和重点方向是微型化、多功能 化、智能化和集成化，开发新一代低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命的生物传感器是目 前研•究的热点3.4 ATP生物发光技术ATP是所有生物生命活动的能量来源，普遍存在于各种活细菌细胞中，并且含量相对稳 定，细菌细胞死亡后几分钟内ATP便被水解消失，故ATP与活菌量直接相关ATP生物发 光技术的原理是荧光素酶在ATP和02以及Mg2+存在的情况下，催化荧光素氧化脱蔑，将 化学能转化为光能，释放出光量子在一定的ATP浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性 关系利用这一原理，可从待测食品中提取ATP,通过测定荧光强度即可确定活菌浓度目 前ATP生物发光法已被用于食品中微生物的快速检测，在HACCP管理中也被广泛用于关 键控制点检测。

ATP生物发光法可用于肉及肉制品杂菌污染的测定、饮料中的微生物测定 ［11］、啤酒酵母的活性测定、海洋食品和调味品的微生物检测等自动ATP生物荧光技术在 欧洲和北美的乳品工业中己广泛应用于生乳活菌数检测、UHT乳活菌数检测、设备清洁度 的评估及成品货架期的推算等3.5环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop —mediated isothermal amplification, LAMP)是由 Notomi 等开 发的一种无需扩增仪、结果可通过扩增副产物的浊度直观判定的新型核酸扩增法他们利用 能识别特异性靶序列上6个位点的2对特异性引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶， 在lh内于恒温条件。