色素家兔脉络膜新生血管中结缔组织生长因子表达.doc

精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询色素家兔脉络膜新生血管中结缔组织生长因子表达【摘要】 目的：通过激光诱导色素家兔脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）模型，探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）在 CNV 形成中的作用方法：用高强度半导体泵浦的倍频 Nd：YAG 532nm 绿激光光凝兔视网膜后极部，诱发 CNV术后 1，3，4wk 用原位杂交方法检测 CTGF mRNA 在 CNV 中的表达结果：光凝后 1wk，CNV 膜开始形成，CTGF mRNA 主要表达于 CNV 及其附近；光凝后 3，4wk，CTGF mRNA 仍明显表达，并有增强的趋势结论：结缔组织生长因子可能参与了实验性 CNV 的发生发展 【关键词】 脉络膜新生血管0 引言黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovasculariz- ation,CNV)膜形成是年龄相关性黄斑变性(age-rela- ted macular degeneration,AMD)、高度近视眼等眼底病中造成视力丧失的最主要精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询原因。

实验诱导和手术切除新生血管膜的组织学和免疫组织化学研究证实多种生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF） 、转化生长因子β（TFG-β）等在 CNV 形成的促进作用[1-5]结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是新近报道的高度保守的即刻早期基因 CNN(CTGF,cyr,nov)家族成员之一，它在伤口愈合和纤维化过程中起主要作用[6-8]最近的研究认为 CTGF 在促进纤维化过程中，也促进血管形成，在体内、体外都促进血管内皮细胞的生成、增生和迁移[9,10]但目前鲜见对 CTGF 和 CNV 关系的研究，我们希望通过激光诱导的 CNV 膜型探讨 CTGF 在 CNV 形成中的作用1 材料和方法1.1 材料 健康有色家兔 24 只，右眼为实验眼，左眼为正常对照雌雄不限，体质量 1.5～2.5kg，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供实验前经裂隙灯、眼底镜检查双眼无异常原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司因为人和兔有 95%的同源性，选用针对人 CTGF 靶基因的 mRNA 序列为 5’-CTGCT GCCGC GTCTG CGCCA AGCAG CTGGG -3’，合成的探针用地高辛 5’末端标记。

DAB 显色剂等其他分析纯均购自武汉博士德公司半导体泵浦的倍频 Nd：YAG 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询532nm 绿激光机（法国 Quantel Medical SA 公司的 Viridis Twin型） ；荧光素眼底血管造影仪（fundus fluorescein angiography，FFA） （日本 Topcon 公司 TRC-50Ex 型） 1.2 方法 复方托品酰胺眼液和新福林散瞳，肌注盐酸氯胺酮（50mg/kg）和地西泮（2.5mg/kg）麻醉后，丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用倍频 Nd：YAG 532nm 绿激光机，在视盘下方 1～2PD 击射 20 点激光击射参数：光斑直径 50μm ，功率 0.8W，时间0.05s，光斑间距 100μm；激光反应斑以见到有气泡出现或少量出血,提示 Bruch 膜被击穿为准，并于激光击射后 7，21，28d 麻醉动物行眼底彩色照像及 FFA 检查于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方标记后置于 40g/L 的甲醛溶液中固定 24h，然后沿赤道部剖开，去除眼前节，取包括视盘及下方的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，以激光斑为中心制成 3μm 厚的连续石蜡切片,一张常规 HE 染色光镜下观察CNV。

选取含 CNV 激光斑的石蜡切片常规脱蜡至水原位杂交方法测定 CTGFmRNA 的表达：30mL/L H2O2 室温处理 10min，30mL/L 檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 37℃消化 30min，期间 0.5mol/L PBS 或 DEPC 水充分洗涤 37～40℃进行预杂交 4h，吸取多余液体，不洗，然后40～42℃杂交过夜杂交后 30～37℃水温的不同浓度的 SSC 充分洗涤，再滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加 SABC，滴加生精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询物素化过氧化物酶，每一步之间用 0.5mol/L PBS 充分洗涤最后,显微镜下控制 DAB 显色时间，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察照像步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用预杂交液代替杂交液染色结果以细胞质内出现黄色或棕黄色为阳性信号2 结果在正常组织中，视网膜脉络膜未见 CTGFm RNA 表达（图 1） 光凝 1wk 后，脉络膜新生血管膜形成光镜下观察主要由色素性巨噬细胞、迁移增殖的 RPE 细胞、神经胶质细胞和长梭形的、胞体较大、胞核为卵圆形的成纤维细胞样细胞组成（图 2） ， CTGFmRNA 一部分阳性标记位于 CNV 及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层（图 3） 。

随着 CNV 发展，CTGFmRNA 阳性染色有增强的趋势图 1 正常色素家兔视网膜 CTGFmRNA 阴性表达 DAB×400精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询光凝术后 1wk（A）光凝术后 3wk(B)CNV 形成（*标记）图 2 色素家兔视网膜 HE×400A：CTGF mRNA 一部分阳性标记于 CNV 及附近组织 DAB×400；B:另一部分标记于血管内皮细胞及神经节细胞层 DAB×200图 3 CNV 色素家兔视网膜 CTGFmRNA3 讨论在许多眼底疾病中，CNV 是造成视力丧失的主要原因之一目前CNV 的确切的病因和发生机制尚不清楚，但一致公认 CNV 形成是一个多细胞多因子参与的生物过程，这个过程中除了血管内皮细胞的关键作用外，其他细胞如周细胞、纤维母细胞、巨噬细胞和其他炎症细胞也被发现在控制眼部血管形成中都有重要作用，而且还有大量的血管形成调节剂，包括氧、血管形成因子、抗血管形成因子、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询细胞外基质、炎症介质等的参与[11]CTGF 属于近年发现的一个新的即刻早期基因家族 CCN（CTGF, Cyr61, nov）的成员。

目前发现CTGF 在 TGF-β 信号通路中起重要作用，CTGF 是 TGF-β 部分生物学功能的下游介质，它具有多种生物学功能,如刺激多种细胞增殖、细胞粘附、趋化性、诱导血管生成[6-10]，促进细胞外基质成分产生等，在肺、肾、心肌纤维化、动脉粥样硬化及肿瘤等病变都有高表达[6,7]上一页 1 2 下一页有研究表明 VEGF 可以提高牛视网膜内皮细胞和周细胞 CTGF mRNA 的表达，呈时间依赖性和剂量依赖性，提出 CTGF 在视网膜新生血管疾病中有重要作用，可能参与血管形成和组织纤维化[10]He 等[12]分析研究了 13 例手术剥离 AMD 的 CNV，并研究了 CTGF 对脉络膜内皮细胞（CEC）的作用发现 CNV 膜上存在强烈的 CTGF 蛋白的表达，免疫双标记显示 CTGF 在 RPE 和 CEC 细胞上共同表达可以显著诱导 CECs 的粘附和移行，但不刺激 CECs 增生转化生长因子 TGF-β 和 VEGF 均可以上调 CECs 中 CTGF 蛋白的表达而Watanabe 等[3]同样的研究发现 CTGF、TGF-β 在 CNV 膜血管内皮细胞、RPE 细胞及间质细胞（成纤维细胞样细胞、多角形血管周细胞）中强烈表达，并且纤维成分占主要的 CNV 膜中的 CTGF 阳性信号强于细胞成分占主要的 CNV 膜，而 TGF-β 的表达相反。

结果表明TGF-β 上调 CTGF 表达，CTGF 在脉络膜新生血管形成的病理发展过精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询程中有重要作用我们发现，光镜下 CNV 膜由色素性巨噬细胞、迁移增殖的 RPE 细胞、和长梭形的成纤维细胞样细胞组成，CTGFmRNA一部分阳性标记位于 CNV 及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层这类细胞是否分泌 CTGF 或有 CTGF的受体存在，还需要进一步的实验证实在激光诱导的 CNV 膜中，CTGFmRNA 在光凝后 1wk 有阳性表达，光凝后 3，4wk，随着 CNV 膜的发展，CTGFmRNA 阳性表达增强这可能是因为 CNV 膜形成是个创伤愈合过程，它包括 3 个阶段：炎症、增生、重塑在 CNV 膜形成初期，细胞多纤维少，处于炎症、增生阶段，这一阶段 TGF-β 被上调，而 CTGF 未被上调 ，间质细胞只有微弱的 CTGF 表达随着 CTGF 被上调，来源于间质细胞的 CTGF 刺激胞外基质的产生，刺激纤维形成随后血管周细胞发生纤维变性促进 CNV 膜的发展纤维化[3]这可能是 CNV 膜后期退化的原因尽管激光诱导的 CNV 模型和人新生血管的发生机制不同，但我们的研究证实 CNV 膜中有 CTGFmRNA 的表达，提示 CTGF 参与了 CNV 膜的形成和发展，但 CTGF 在 CNV 膜中的作用方式和基因调控机制还需要进一步的研究。

参考文献】精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1 Grossniklaus HE, Green WR. Choroidal neovascularization. Am J Ophthalmol ,2004;137(3):496-5032 Oh H, Takagi H, Takagi C, Suzuma K, Otani A, Ishida K, Maumura M, Ogura Y, Honda Y. The potential angiogenic role of macrophages in the formation of choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1999;40(9):1891-18983 Watanabe D, Takagi H, Suzuma K, Oh H, Ohashi H, Honda Y. Expression of connective tissue growth factor and its potential role in choroidal neovascularization. Retina ,2005;25(7):911-9184 Yang XM, Wang YS, Hui YN. Endogenous inhibitors for choroidal neovascularization. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ,2004;4(2):307-3115 Zhou YD, Zhou TQ, Fan HJ. Transpupillary thermotherapy of choroidal neovascularization in patients with age-related macular degeneration. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ,2005;5(5):961-963精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询6 Kucich U, Rosenbloom JC, Herrick DJ, Abrams WR, Hamilton AD, SebtiS M, Rosenbloom J. Signaling events re。