胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的体外培养.pdf

Aug. 2009, Volume 6, No.8 (Serial No.57) 美中医学 Journal of US-China Medical Science, ISSN 1548-6648, USA 19 胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的体外培养 王晓峰，刘建新，李拴德，张荣军，杨兴奎 （解放军第三医院神经外科研究所，陕西宝鸡 721004） 摘 要：目的 探讨胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的培养、分化和鉴定技术方法 从胚胎大鼠纹状体 区分离神经干细胞，用无血清培养技术进行体外原代培养、传代，加血清进行诱导分化荧光免疫染色技术进行鉴定结果 从胚胎大鼠纹状体区分离出神经干细胞，并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶 质细胞结论 采用该体外培养技术分离的纹状体区神经干细胞可在体外大量增殖，并有多向分化潜能 关键词：纹状体；胚胎；神经干细胞 Cultivation of embryonic striatum-neural stem cells from rat in vitro WANG Xiao-feng, LIU Jian-xin, LI Shuan-de, ZHANG Rong-jun, YANG Xing-kui Abstract: Objective To explore the cultivation, differentiation and indentification of embryonic striation-neural stem cells from rat. Methods The advantage of serum free and clone culturing technology was performed to isolate, cultere, passage and induce neural stem cells from embryonic rat cortex, hippocampus and striatum. Immunofluorescence was applied to identify the neural stem cells and there potential of differentiation. Results The cultivated cells had the ability to proliferate continuously and cultivation differentiated into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Conclusion The technique of the separation of in vitro neural stem cells in the striatum may proliferate a large number in vitro and have more differentiation potential. Key words: embryonic;striatum; neural stem cells 【作者简介】王晓峰（1972-），男，解放军第三医院神经外科研究所，神经外科学硕士；研究方向：神经外科疾病的综合 治疗。

神经干细胞（Neural stem cell，NSC）因其具 有极大的增殖潜能，并能分化为神经元、神经胶质 细胞等神经系统细胞，且无产生畸胎瘤的危险，是 神经系统细胞治疗的良好移植材料但从成体获得 神经干细胞材料来源稀少， 难以识别， 分化和纯化， 难以有足够的细胞数量用于移植而限制了其临床 应用而胚胎干细胞可在体外无限扩增，易于遗传 操作，因此，胚胎细胞是再生移植供体的理想来源[1]本研究在无血清培养条件下，利用特定的生长因子，使大鼠胚胎 NSC 稳定增殖传代并可分化出 神经系统的三种基本细胞，为进一步探讨大鼠胚胎 NSC 移植的临床研究奠定基础 1. 材料与方法 1.1 材料和试剂 15 d 孕龄大鼠胚胎；DMEM/F12 培养基、表皮 生长因子（epidermal growth factor，EGF） 、碱性成 纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF） 、 青链双抗、 神经元特异性烯醇化酶 （neuron specific enolase，NSE）抗体、胶质纤维酸性蛋白 （filialfibrillary acidic protein，GFAP）抗体、小鼠 抗大鼠单克隆巢蛋白（nestin）抗体购自美国 Sigma 公司；B27、胎牛血清（fetal calf serum，FCS）购胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的体外培养 20 自 Gibco 公司。

在基础培养基中加入下列成分：20 μl 的 EGF，10 g/L 或 20 g/L 的 bFGF，20 mg/L 的 B27.1％青链双抗，配制成 NSC 无血清培养液 1.2 NSC 的分离及原代培养及传代 参照冯力等[2]的研究方法，取孕龄 15 d 的大鼠 胚胎，断髓处死，放入 75%酒精中浸泡消毒 2 min， 超净工作台上取出胚鼠脑组织在解剖显微镜下分 离脑膜，切取纹状体，用 PBS 洗 3 次，剪刀剪碎， 加大鼠 DMEM/F12 培养基，通过 200 目不锈钢滤 网用基础培养基洗涤离心后，用 NSC 培养基重 新悬浮细胞，改良牛鲍技术盘计数活体细胞至浓度 为 5×105个/ml， 吸取 2 ml 接种于 50 ml 的玻璃细胞 培养瓶，置于 37℃，5%CO2、饱和湿度培养箱中连 续培养，2～3 d 半量换液在培养到第 7～10 d 时， 根据细胞的生长状况和密度，吸除一半培养基，机 械法吹散 NSC 球后， 重新用 NSC 培养基悬浮细胞， 然后转入新的培养瓶中继续培养和传代 1.3 NSC 的鉴定 对原代和传代培养的 NSC 行 Nestin 免疫荧光 染色 吸取适量的NSC球， 离心800 rpm/min， 5 min， 加含 5% FCS 的 NSC 培养基， 接种于涂有多聚赖氨 酸盖玻片的培养皿中。

培养 4 d 后 PBS 洗 3×5 min， 室温下 4%多聚甲醛固定 l5 min，PBS 洗 3×5 min， 加大鼠 0.2%的 Triton－X100 作用 15 min，PBS 洗 3×5 min，用山羊血清封闭液在 37℃湿盒内封闭 30 min，加一抗 Nestin（1:50） ，4℃过夜，PBS 洗 2×5 min，加大鼠 1:100 稀释的二抗（TRITC 标记的羊 抗鼠 IgG） ，室温孵育 4 h，PBS 洗 3×5 min，封片 在荧光显微镜下观察并照相记录结果 1.4 NSC 的诱导分化及鉴定 参照荣晓等[3]的研究方法对原代培养 7 d 的 NSC， 加入含5％血清的DMEM/F12进行诱导分化， 14 d 贴壁分化后行免疫荧光染色鉴定操作步骤同 上， 一抗浓度分别是： NSE （1:100） ， GFAP （1:100） ， Galc-C（1:100） 2. 结 果 2.1 胎鼠纹状体神经干细胞原代培养及传代 倒置相差显微镜下，可见刚培养的细胞散在且 胞体较小，呈圆形，折光性较好第 2 天后，单个细胞大量减少，培养板底见许多细胞碎片，部分胞 体较大、圆形、折光性较强的悬浮细胞发生分裂， 部分细胞有出芽现象（不对称分裂） 。

3 d 后逐渐形 成由数个细胞组成的细胞球，7 d 时细胞呈碎渣样 死亡，存活细胞以单细胞或细胞球形式悬浮于培养 基中存活的细胞已形成由数个到几十个细胞组成 的细胞球 体外培养 10 d 后， 随着细胞球不断增大， 可形成上百个细胞的大克隆，部分细胞球贴壁放射 状向四周发出突起， 克隆间可有纤维相连 传代后， 在培养基中既可见到单细胞，也可见到呈不规则形 状的小细胞团传代后部分细胞死亡，而部分单细 胞则出现分裂相，逐渐形成由较多细胞组成的细胞 球，生长速度基本同原代培养，但成球速度明显快 于原代 2.2 Nestin 抗原检测结果 神经干细胞选择性的表达神经巢蛋白，属胞浆 中的中间丝蛋白经传代培养的神经干细胞球和单 个神经干细胞Nestin免疫荧光显示均有明显的荧光 阳性着色 2.3 神经干细胞克隆及诱导分化及鉴定 在接种涂有 0.025%多聚赖氨酸包被盖玻片上 的原代和传代培养的神经干细胞克隆球在含 5%小 牛血清的DMEM/F12培养基中培养3 h左右见细胞 集落己贴壁，8 h 后即发现有突起从细胞团块边缘 生长，24 h 后见有少数细胞分化为有突起的细胞， 以后分化的细胞逐渐增多，从克隆球周围迁移出， 呈放射状排列，随着时间的推移，突起不断增粗与 延长并相连接成网状，2～3 d 后在相差显微镜下观 察发现克隆球分化成大量形态不一、圆形或椭圆形 胞体， 含有 1 个或 2 个长突起的， 行 NSE 荧光染色 时发红色荧光，为神经元样细胞，和具有细胞突起 目不断分枝的，行 GFAP 荧光染色时发浅蓝色荧光 的星形胶质细胞样细胞及含有多个粗短突起的，行 Gale-C 免疫荧光染色发淡蓝色荧光的少突胶质细 胞样细胞。

3. 讨 论 NSC 的发现彻底改变了人们对中枢神经损伤 再生的认识， NSC 的多分化潜能使其成为中枢神经 细胞替代治疗的理想移植材料利用它不仅可以探胚胎大鼠纹状体区神经干细胞的体外培养 21讨神经系统发育的分子机制，也可作为细胞移植治 疗中枢神经系统损伤、退行性疾病及脑肿瘤等疾 病 大量体外实验证实EGF和bFGF能促使神经干 细胞存活和增殖EGF 促进 NSCs 的长期存活，而 bFGF 则可能对 NSCs 向神经元和部分向胶质细胞 分化起到一定的作用本研究结果表明，从胎鼠纹 状体分离培养出的 NSC 在无血清培养条件下，在 EGF 和 bFGF 刺激下这种 NSC 能不断分裂增殖， 形 成神经球；在同样条件下，能不断传代形成新的神 经球； 在一定条件下 （从培养基中除去 EGF 和 bFGF 后，或再加入 FCS 进行有血清培养） ，NSC 能分化 出神经元或神经胶质细胞在初代培养中，呈球形 生长的克隆球若生长过大，中央部分细胞会因缺乏 营养而出现克隆球形成率低甚至死亡，表现为克隆 球的折光性减低甚至于发黑现象因此必须及时将 干细胞克隆球进行分散和传代 NSC 缺乏成熟神经 元或胶质细胞的特征性标志，但表达一种中间丝蛋 白 Nestin， 该蛋白日前已作为 NSC 的特征性生物学 标志被广泛应用于 NSC 的鉴定。

我们在 NSC 生长 的稳定增殖期，即原代培养或传代培养的 7～10 d， 获取 NSC 克隆球，对克隆球和贴壁分化的细胞进 行免疫荧光染色，细胞球均为 Nestin 阳性在贴壁 分化过程中，Nestin 的表达越来越少，出现了神经 元的标志性蛋白 NSE， 和星形胶质细胞特征性蛋白 GFAP 以及少突胶质细胞的标志蛋白 Galc-C说明 此方法可以培养出具有多向分化潜能的 NSC， 且这些 NSC 在外源性因子的调节下可以维持自我更新 的状态并可以稳定的增殖传代，产生具有相同活性 的子代细胞 总之，干细胞的来源、分离、培养及鉴定还有 许多工作要做，干细胞诱导、分化及迁移机制有待 进一步研究；目前建立的干细胞系绝大多数来源于 鼠，而鼠与人之间存在着明显的种属差异、免疫反 应，如何控制细胞的增殖，移植病原体；干细胞转 染范围的非选择性表达及转基因表达的原位调节； 利用胚胎干细胞存在着社会学及伦理学方面的问 题等[4]但随着科学技术的发展，上述存在的问题 将逐步解决，干细胞的应用将有广阔的前景 参考文献： [1] 陈红，钱坤，鲁文果，等. 小鼠胚胎干细胞体外向神经 干细胞的分化研究[J]. 卒中与神经疾病， 2005， 12 （2） ： 67-70. [2] 代荣晓， 。