小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定,实验目的,掌握小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活力测定的原理和方法,酶活力：,在最适反应条件（,25,）下，每分钟内催化,1,mol,底物转化为产物所需的酶量为一个,酶活力单位，即,1U=1,mol/min,酶的比活力：,代表酶的,纯度,，用每,mg,蛋白质所含的酶活力单位数表示比活力,=,活力（,U,）,/,蛋白（,mg,）,=,总活力（,U,）,/,总蛋白（,mg,）,酶活力的测定方法：,分光光度法；荧光法；同位素测定法；电化学法,基本知识,蛋白质（酶）的分离纯化,根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等性 质 方 法,分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤,溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀,电荷 电泳、离子交换层析,吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水层析）,配体分子 亲和层析的生物亲和力,1,、粗分级分离,主要是利用,盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀,等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的,特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质,，但分辨率低。

1,）盐析,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，使蛋白质脱去,水化层,而聚集沉淀，这种现象称为,盐析,盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层分段盐析,不同蛋白分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不同，因此调节盐浓度，可使不同的蛋白质分别沉淀，如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH,4,),2,SO,4,50%,饱和度,完全饱和,析出,析出,常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性透析,是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在具半透膜（玻璃纸、火绵纸等）性质的透析袋里，放在蒸馏水中进行透析，可不断更换蒸馏水直至杂质被除去透析袋,蛋白质溶液,蒸馏水,蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐来进一步提纯脱盐常用,透析法,2,）等电点沉淀,蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液,pH,变化而变化。

在溶液,pH,值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液,pH,到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白3,）有机溶剂法,与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低原因？,降低水的介电常数,，使蛋白质分子表面可解离基团的,离子化程度减弱，水化程度降低,，促进了蛋白质分子的聚集沉淀极性有机溶剂与蛋白质,争夺水化水,，而使蛋白质分子沉淀常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质2,、细分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法常用的柱层析方法有,分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析,常用的电泳方法有,聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳,另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用3,、酶的活力测定,在酶的制备过程中，每一步骤都应测定酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。

总活力,=,活力单位,/ml,酶液,总体积（,ml,）,比活力,=,总活力单位数,/,总蛋白（,mg,）,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,回收率（产率）,=,（每次总活力,/,第一次总活力）,100%,实验原理,小牛肠碱性磷酸酶分子量为,145000,，等电点为,5.7,在体外可催化底物,对硝基苯磷酸二钠,生成,对硝基苯酚,，后者在,405nm,光波长下有最大吸收，通过测定吸收值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力实验器材：,新鲜小牛肠、匀浆机、离心管、剪刀、载玻片、离心机、滤布、,762,型分光光度计试剂：,正丁醇、丙酮（,-20,预冷），,1mol/L HAc,，,1mol/L NaOH,，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠平衡缓冲液,：,0.01mol/L Tris-HCl,（,pH8.0,），含,1.010,-3,mol/L MgCl,2,和,1.010,-5,mol/L ZnCl,2,底物缓冲液,：,1mol/L,二已醇胺,-,盐酸缓冲液（,pH9.8,），含,0.510,-3,mol/L MgCl,2,酶的底物溶液,：用底物缓冲液配制,1510,-3,mol/L,对硝基苯磷酸二钠溶液。

实验步骤,1,、取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮小肠粘膜到烧杯里2,、所有组都倒入匀浆机里，加,1.5,倍体积冷蒸馏水，搅拌均匀，高速匀浆三次，量总体积取出,2ml,测酶活和蛋白质的含量3,、取适量匀浆液加入,1,倍体积,正丁醇,，搅拌，于,100ml,离心管，在,4,下，,10000rpm,离心,10min,离心前一定注意配平,),4,、用分液漏斗取下层水相，用滤布过滤出除杂质，用,1mol/L HAc,调,pH,到,4.9,，,10000rpm,离心,10min,，除沉淀5,、上清用,1mol/L NaOH,调,pH,至,6.5,，称硫酸铵至,5%,，加入离心管，加,0.47,倍体积,冰冷丙酮,，混匀，,4,放置,30min,以上6,、,4,，,8000rpm,离心,10min,，除沉淀，上清（测酶活）加入,1.07,倍体积冷丙酮，,4,放置,30min,以上7,、,4,，,8000rpm,离心,10min,，其上清，将沉淀溶于,2ml,平衡缓冲液，（向溶液中加入硫酸铵至,35%,，混匀，,4,，,8000rpm,离心,10min,，除沉淀8,、上清加入硫酸铵至,65%,混匀，,4,，,8000rpm,离心,10min,，沉淀溶于,2ml,平衡缓冲液。

9,、将称量溶解好的酶的底物（对硝基苯磷酸二钠）,37,保温,5min,，取底物,1.5ml,加入玻璃比色杯（小型）中，加入,1050,l,酶样品液，立即在,405nm,波长下，按,Start,键，设定,120,秒，画出酶动力学曲线其中的酶样品液要测量蛋白质浓度，计算比酶活力单位酶活力（,U/mg,）,=,（,A/t,）,V,R,D/,E,405,V,E,c,A,：,405nm,波长下吸光度的变化,t,：时间，,min,；,V,R,：反应液的体积；,D,：稀释倍数；,E,405,：,405nm,波长下对硝基苯酚的摩尔吸收系数，,18.3,；,V,E,：所加酶液体积；,c,：酶液浓度10,、蛋白质的测定：,将酶样稀释,1025,倍，取,0.1ml,，加,5ml,考马斯亮蓝，在,595nm,波长下测吸光值，确定蛋白浓度1,、小牛肠碱性磷酸酶的分子量是多少？等电点是多少？,分子量为,145000,，等电点为,5.7,2,、何谓酶活力（单位）？,在最适反应条件（,25,）下，每分钟内催化,1,mol,底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即,1U=1,mol/min,3,、何谓盐析？盐溶？,蛋白质溶液中加入大量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为,盐析,。

蛋白质溶液中加入少量的中性盐,(NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，会增加蛋白质与水分子的作用，从而使蛋白质在水中的溶解度增大，这种现象称为,盐溶,思考题,4,、与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，为什么？,降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀5,、为什么先将有机溶剂冷却，然后边搅拌边逐渐加入到蛋白质溶液中？,常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题6,、本实验中正丁醇的作用是什么？,小牛肠碱性磷酸酶为膜结合酶，具有典型的两亲性质，其疏水端锚定在微绒毛膜上匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。