生化工程6-种子扩大.ppt

种子扩大培养种子扩大培养 种子扩大培养是指将保存在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程这些纯种培养物称为种子种子n n 种子扩大培养应根据菌种的生理特性菌种的生理特性，选择合适的培养条件合适的培养条件来获得代谢旺盛、数代谢旺盛、数量足够的种子量足够的种子n n 培养良好的种子接入发酵罐后，可使发发酵生产周期缩短，设备利用率提高酵生产周期缩短，设备利用率提高种子液质量的优劣对发酵生产起着关键作用关键作用优良种子应具备的条件优良种子应具备的条件n n活力强n n生理状态稳定n n菌体数量浓度达到要求n n无杂菌污染n n适应性强，能保证稳定生产种子制备种子制备实验室制备阶段实验室制备阶段n n 实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养实验室阶段实验室阶段培养物选择的原则培养物选择的原则目的：种子扩增到一定的量和质，根据菌种的特点可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子n n（一）孢子的制备（一）孢子的制备n n1 1，细菌孢子的制备，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。

培养温度一般为方培养温度一般为3737细菌菌体培养时间一般细菌菌体培养时间一般为为1212天，产芽孢的细菌培养则需要天，产芽孢的细菌培养则需要510510天n n2 2，霉菌孢子的制备，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基培养的温度一般为麦粒等天然农产品为培养基培养的温度一般为25282528培养时间一般为培养时间一般为414414天n n3 3，放线菌孢子的制备，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等培养温度一般为豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等培养温度一般为2828培养时间为培养时间为514514天n n 孢子培养基是为了获得孢子，应注意避免孢子发育为菌体，所以通常使用营养限制的固体培养基n n（二）液体种子制备（二）液体种子制备n n 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌可以用摇瓶液体培养法。

将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子其过程如下：n n 试管三角瓶摇床种子罐 生产车间种子的制备生产车间种子的制备n n 孢子或摇瓶菌丝在实验室中制备好后，即可转移到种子罐中扩大培养n n 种子罐的作用是使有限的数量的孢子或菌丝生长繁殖成大量的菌丝体n n 种子罐的培养基因不同菌种而异，但其原则为营养丰富，采用易被菌利用的成分采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，同时应考虑与发酵培养基成分相靠近生产车间阶段生产车间阶段培养物的选择原则：培养物的选择原则：在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体种子扩大的级数种子扩大的级数n n指制备种子需逐级扩大培养的次数，需要根据菌种的生长繁殖速率，发酵罐的容积综合确定n n一级种子二级发酵：谷氨酸棒杆菌n n二级种子三级发酵：青霉菌n n三级种子四级发酵：灰色链霉菌n n种子罐级数种子罐级数取决于：n n（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；n n（2）所采用发酵罐的容积n n细菌细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵n n霉菌霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 n n放线菌放线菌：生长更慢，采用四级发酵n n酵母酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。

也须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率接种龄与接种量接种龄与接种量n n接种龄接种龄：种子的培养时间n n种龄过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长n n种龄过于年老：导致生产能力衰退n n接种量接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例n n接种量的选择：根据菌种的区别各有不同，高可达发酵罐的25%n n通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%n n 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，节约动力消耗，减少染菌机会但接种量过大或者过小，均会影响发酵过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率双种双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中倒种倒种：部分种子来源于发酵罐种子质量的判定种子质量的判定n n通常测定的参数包括n npHn n培养基中营养物质的含量n n菌丝形态、色泽、浓度n n酶活，溶解氧，尾气等n n种子质量标准种子质量标准n n1，细胞或菌体n n菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）n n单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列方式；n n霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

n n2，生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化n n3，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联影响种子质量的因素n n培养基原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同n n培养条件 如温度、如温度、PHPH值、湿度、培养时间和冷藏时间等值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量都影响种子质量种子质量的控制种子质量的控制n n菌种的稳定性检查与复壮n n无杂菌检查青霉素生产的种子制备青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵斜面孢子斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天，湿度天，湿度50%左右左右大米孢子大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高，成本低、米粒之间结构疏松提高，比表面积大，利于氧的传质，营养适比表面积大，利于氧的传质，营养适当有利于孢子的生长。

当有利于孢子的生长培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子一级种子一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨二级种子二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%质量要求质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团少青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强发酵工艺控制发酵工艺控制n n微生物发酵过程可分为，分批，分批补料，半连续和连续等几种发酵方式不同的发酵工艺方式各有其优缺点分批发酵分批发酵n n分批发酵：接种后成为准封闭系统，除了通气外没有别的物质交流微生物生长分为：停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在停滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂分批发酵分批发酵当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。

这个时期称为对数生长期随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期二次生长曲线二次生长曲线分批培养各时期的分批培养各时期的影响因素和意义影响因素和意义菌种菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除接种量增大可缩短甚至消除延迟期；延迟期；培养基成分：培养基成分：1、在营养成分丰富的天然培养基上在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；2、接种、接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近影响延滞期长短的因素：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短延滞期的措施有：1、增加接种量；（群体优势-适应性增强）2、采用对数生长期的健壮菌种；3、调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。

4、选用繁殖快的菌种对数期的应用意义对数期的应用意义n n1、此时期的菌种比较健壮，增殖菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；n n2、发酵工业上应延长该期，以达到较高的菌体密度n n3、尽量使有害微生物不能进入此期n n4、是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料稳定期的应用意义稳定期的应用意义n n发酵产物形成的重要时期（抗生素等），发酵产物形成的重要时期（抗生素等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：如下：n n 补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）n n 调调pH n n 调整温度调整温度 代谢产物生成与微生物生长的关系代谢产物生成与微生物生长的关系n n微生物发酵中，所消耗的底物主要用于3个方面：1、合成新的细胞物质 2、合成代谢产物 3、提供能量n n 以细胞生长，产物合成和底物消耗的变化，可以画出不同状态下的菌种的代谢曲线分析关系，掌握规律，发现问题，改善工艺）按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型(a)：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度(b)：部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式。

部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式c)：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的浓度有关浓度有关生长相关型生长相关型n n指产物的生产与细胞的生长密切相关，产物的生成是微生物主要能量代谢的直接结果n n产物通常为细胞生长必须的初级代谢产物，如葡糖酸，单细胞蛋白等生长部分相关型生长部分相关型n n产物是能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物，产物的生成与细胞生长部分偶联n n主要有柠檬酸、氨基酸发酵非生长相关型非生长。