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Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理1. 采样：1.1 采样前的准备：DEPC水，灭菌手术刀剪，75% 酒精，2 mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染1.2采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品取样量约100 mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RNA保存液中）冻存，最后统一转入-70 ℃冰箱根据实验条件选择RNA样品的保存方式，优先选择液氮保存建议: 如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70 ℃冰箱时管盖崩开使样品损失2. 总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法2.1 Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75% 酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害此外，要提前制冰备用1) 每50-100 mg样品加1 ml Trizol，使用高通量研磨仪研磨30 s。

2) 研磨后样品放置5 min，4 ℃12 000 g离心10 min，上清液转移到另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）3) 加入200 L氯仿，用力摇晃15 s，室温放置5 min4) 4 ℃ 12 000 g离心15 min，上清液转移至另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）5) 加入500 L异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，沉淀RNA6) 4 ℃ 12 000g离心10 min，弃上清7) 加入1 ml 75% 乙醇（DEPC水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀8) 4 ℃ 7 500 g离心5 min，弃去乙醇9) 用微型离心机将EP管内壁上的乙醇甩至管底，用10 μL枪头吸出，打开盖子置于超净台内晾十几秒，但不能让RNA全部干透，内壁上没有水珠即可10) 根据RNA的量加入无Rnase水60-120 μL，轻弹管壁，充分溶解RNA，混匀后分装出少许用于测定RNA浓度以及用于电泳检测11）测定OD260/OD280值以及RNA浓度取1 μL RNA用DEPC水稀释100倍，紫外分光光度计下读取RNA浓度值和OD260/OD280值（1.9-2.0之间表示RNA纯度较好，小于1.8说明含蛋白质、杂质较多，大于2.2表示RNA降解）。

建议：建议使用200 μL的枪头转移上清液，可减少蛋白污染可用柱式RNA提取试剂盒，推荐TAKARA公司的产品，提取速度快，无毒性，质量很好，价格比较高Trizol推荐invitrogen公司的产品，直接从公司订购要1200元/100 mL，从科昊泽订只要750元/100 mL，所以可以多咨询比对代购的价格3. 反转录cDNA 多用转录试剂盒进行cDNA反转录，按照对应说明书操作即可反转录过程需在超净台中进行 Invitrogen和TAKARA的cDNA反转录试剂盒的质量很高Invitrogen的试剂盒步骤稍微繁琐，但最后得到的终产物量多TAKARA的转录速度快，但终产物量少 我所用过的产品Invitrogen的货号是C28025-032（50次反应），TAKARA的是PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time，货号DRR036A（200次反应），和之后用的荧光定量试剂盒可以搭配使用建议: cDNA体系中RNA模板的浓度要一致，可用体系要求模板浓度和所测出的RNA浓度计算所需加模板量和无RNA酶水的量推荐用excel计算，并打出表格，参照表格进行加样。

4. 引物PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列引物的优劣直接关系到PCR产物的特异性及成功与否根据试验选择引物做Real-time PCR的引物片段最好在200 bp以下可通过查找相关英文文献来选择引物，文献中会标注目的基因的引物、引物片段长度和在NCBI上的编号如果引物查找不到，也可自行设计，在NCBI上查找所需基因，得到基因的碱基序列，用DNAMAN设计确定了引物序列后，交由公司订购，获得引物后需要验证是否能用建议：实验室所用引物主要在invitrogen公司设计，3天左右能获得引物，也可以在金维智设计引物国内公司生产速度较快， 1天左右就能完成5．Real time PCR使用TAKARA的SYBR Premis Ex Taq II（Perfect Real Time）试剂盒试剂盒的实验原理如下：SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合后会发出荧光，通过检测荧光信号的强弱，不但可以检测反应体系中的DNA的扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA熔解温度。

具体原理见下图：嵌合荧光染料法原理图根据说明书中不同的荧光定量仪器对应反应体系配制不同的反应液耗材多用96孔板（半裙边）和8联管（8联TUBE）加样方式推荐先用无菌离心管混好除样品外的所有试剂，颠倒混匀，短暂离心，再分装到每个PCR管中，取第一管时用枪头吹打数次分装好后，再向管中加入样本按照说明书要求设置程序后，开始进行PCR扩增每个样品做2-3个重复，初上手建议做3个重复，数据处理时比较好剔值扩增结果中Ct值标准差小于0.5时表示技术重复性好5． Comparative Delta-delta Ct法Comparative Delta-delta Ct法即ΔΔCt法，是一种常用的相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可此方法的缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差所以在正式试验开始前，必须对目的基因和看家基因做标准曲线，如果两组标准曲线的斜率之差小于0.1，那么后续实验中就可以用ΔΔCt法进行相对定量分析反之，如果斜率差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。

只能优化反应条件或选择绝对定量方法进行分析荧光定量仪器所带的软件可以给出两组标准曲线的R2值、扩增效率、斜率等信息如下图所示：对样品进行梯度稀释（1:5），分别对目的基因（HIF-1）和看家基因（actin）做标准曲线二者斜率分别为-3.159和-3.264，差值小于0.1，所以可以用ΔΔCt法对两种基因进行检测进行正式试验，对看家基因和目的基因进行扩增，得到一系列Ct值导出数据前，可以先在软件中进行数据处理调整所有结果中同种基因阈值（Threshold）相同根据熔解曲线（Melt Curve）剔除熔解曲线异常的数据导出数据后，根据相对定量公式（2-ΔΔCt）计算每个样品基因的相对表达量样品目的基因Ct Mean看家基因Ct Mean△Ct△△Ct2-ΔΔCt对照组X1X2X1-X2实验组Y1Y2Y1-Y2(Y1-Y2)-(X1-X2)2-(Y1-Y2)-(X1-X2)△Ct= Ct Mean目的基因- Ct Mean看家基因；△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组；实验组和对照组的基因表达差异为2-ΔΔCt数据统计方法根据试验设计进行选择目 录内容提要写作提纲正文一、资产减值准备的理论概述………………………………………………4（一）固定资产减值准备的概念……………………………………………4（二）固定资产减值准备的方法……………………………………………5（三）计提资产减值准备的意义……………………………………………5二、固定资产减值准备应用中存在的问题分析……………………………5（一）固定资产减值准备的计提模式不固定………………………………5（二）公允价值的获取………………………………………………………6（三）固定资产未来现金流量现值的计量…………………………………7（四）利用固定资产减值准备进行利润操纵………………………………8三、解决固定资产减值准备应用中存在的问题的对策……………………10（一）确定积累时间统一计提模式…………………………………………10（二）统一的度量标准………………………………………………………11（三）提高固定资产可收回金额确定方式的操作性………………………11（四）加强对固定资产减值准备计提的认识………………………………12（五）完善会计监督体系……………………………………………………12参考文献………………………………………………………………………15内容提要在六大会计要素中，资产是最重要的会计要素之一，与资产相关的会计信息是财务报表使用者关注的重要信息。

然而长期以来，我国的企业普遍存在资产不实、利润虚增的情况，从而使资产减值问题一度成为我国会计规范的热点问题人们也期望通过会计上的法律法规减少信息的不对称，让企业向广大投资者提供真实有效的信息在企业生产经营过程中，资产减值是一个不可避免的现象，本文通过对新旧会计准则的对比，针对会计实务中对资产减值准备会计处理，分析资产减值准备在会计实务操作中的存在的问题，并对新会计准则下的会计处理方法进行分析与评价，进而提出解决问题的方法，阐述了资产减值准备提取在实务操作中面临的境况从资产减值准备入手，对固定资产减值准备进行分析，提出了计提标准不恰当，计提时间未作统一规定等问题，并针对存在的问题提出了分析方法等对策写 作 提 纲一、资产减值准备的理论概述（一）固定资产减值准备的概念（二）固定资产减值准备的方法（三）计提资产减值准备的意义二、固定资产减值准备应用中存在的问题分析（一）固定资产减值准备的计提模式不固定（二）公允价值的获取（三）固定资产未来现金流量现值的计量（四）利用固定资产减值准备进行利润操纵三、解决固定资产减值准备应用中存在的问题的对策（一）确定积累时间统一计提模式（二）统一的度量标准（三）提高固定资产可收回金额确定方式的操作性（四）加强对固定资产减值准备计提的认识（五）完善会计监督体系固定资产减值准备问题的探讨随着我国经济的发展，市场经济日益完善，大众对企业会计信息披露要求也逐步提高。

而市场经济的完善，竞争的加剧，企业对其交易方会计信息要求也提高，国家为了宏观调控的需要，也需要企业提供大量真实的会计信息新企业会计准则规定，“资产减值损失一经确认，在以后会计期间不得转回”是不可逆性的规定按照财务会计的谨慎性原则，预期不会带来经济利益的资源就不应列入资产，预期不会带来原预计额的经济利益的资源要折扣后列入资产，即减除预计减值后的部分才是能带来经济利益的资产本文通过对我国会计准则中的资产减值准备会计问题的研究，理论上提高企业对现行资产减值准则的认识，促进企业完善企业相关会计核。