实验一-碱裂解法提取质粒DNA.doc

实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、 实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术质粒作为载体应具备下列四个特点：① 有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖② 在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选③ 与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等）④ 拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

二．实验试剂1，SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加入Sol I中)，高压灭菌，4°保存 2，SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml使用前将两种溶液混合3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml高压灭菌，4°保存4，70%乙醇 无菌水DDW5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套三、实验步骤按1/100的比例接种保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数生长期)将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37℃、250rpm剧烈震荡培养过夜1、离心管（10mL）分装菌10ml，离心去上清（10000rpm，5min，4℃）；弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。

2、重悬于800µl 冰冷的SolⅠ中；剧烈震荡重悬菌体3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min（SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）4、加入1.2mL冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min5、4℃，12000rpm离心10minSolⅢ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,沉淀核酸，室温放置大于10min12000rpm离心5min，小心移出上清于一新离心管中7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心12000rmp×10min8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥10、将沉淀溶于50μl DDW中，储于-20℃冰箱中思考题：1、 加入酚/氯仿/异戊醇的作用？2、 沉淀DNA时为什么用无水乙醇？实验结果：(请大家详细讨论自己组的实验结果) A组：B组：。