生物学 10基因工程- 基因文库的构建.ppt

第六部分 基因文库的构建一、基因文库的概述 二、基因组DNA文库的构建 三、cDNA文库的构建1、基因文库(gene library)概念ž是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存 在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要 时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这 种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库 又称DNA文库ž基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组 成一、基因文库的概述2、基因文库的分类ž 基因组DNA：提取的染色体基因组DNA如果要研究 的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存 在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色 体基因组DNA中获得ž cDNA：mRNA反转录成的cDNA 如果研究的目标是 弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的 cDNA分子的核苷酸序列直接推导出来ž 基因组文库（genomic library）含有全部基因 ž cDNA文库（cDNA library）含有全部蛋白质编码的 结构基因 ž 用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNAž 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNAž 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段 的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。

很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库1)基因组文库(Genomic library) ž 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切 酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再 与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞 获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基 因组文库 ž 目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全 部基因 ž 基因组文库根据DNA来源分为：核基因组文库、叶 绿体基因组文库、线粒体基因组文库 ž 克隆外源 DNA片段的切割主要采用机械断裂或限 制性部分酶解两种方法，其基本原则： ž①DNA 片段之间存在部分重叠序列 ž②DNA 片段大小均一2) cDNA文库 (cDNA library) ：ž 是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的 克隆的集合ž cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的 某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外 反转录后形成的互补DNAž 基因组文库与cDNA文库的最大区别：ž 基因组文库含有而cDNA文库不含有非转录的基因组 序列。

63、构建基因文库的基本方法ž将特定生物体的因组DNA或cDNA分解成适当大小的DNA片段,然后分别与克隆载体连接成重组DNA分子ž通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆二、基因组文库的构建(一)基因组文库的类型ž根据所选用的载体可以分为：ž质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）二)基因文库的完备性ž基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一 基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之 间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )（三）基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：ž 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力ž 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆ž 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序ž 克隆片段易于从载体分子上完整卸下ž 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选※(四)基因组文库构建的一般步骤 ① 载体的选择和制备② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取。

③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离④ 载体与DNA片段的连接⑤ 转化或侵染宿主细胞⑥筛选鉴定基因组及保存①载体和受体的选择ž 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体 通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒；对于大型基因 组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多 数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建 的载体通常选质粒或-DNAž 上述几种载体的最大装载量如下：ž 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌②基因组DNA的制备ž 为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性， 用于 基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过 度的断裂制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大 小的3－5倍），文库的重组率和完备性也就越高ž 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右ž 如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS 蛋白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大 小的DNA片段 AAAA③基因组DNA的切割ž 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波 处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： ž①保证DNA片段之间存在部分重叠区。

ž②保证DNA片段大小均一ž 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 ž 部分酶切法一般选用4碱基识别序列的限制性内切酶， 如：Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控ž 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进 行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！ ！！④载体与DNA片段的连接ž在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前 先使用小体系连接来寻找最佳比例！ž方法一：粘末端连接ž方法二：人工接头法⑤转化或侵染宿主细胞ž在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效 率高的ž进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！（五）基因组文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：ž 严禁外源DNA片段之间的连接！！！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：ž 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离ž 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团ž 在DNA片段的末端添加人工接头 六）构建基因组文库应注意的问题ž构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。

ž不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆 ž部分消化产产品应应当是一组组覆盖整个基因组组的随机片段识别识别 4个碱基的限制酶要比识别识别 6个碱基酶能产产生更随机的插入片段部分消化所产产生的片段应应能连连接到设设定的载载体上限制酶和部分消化过过程应应事先检查检查 一些批次的酶质质量不够够高而导导致产产生的DNA片段末端不能有效地连连接如果预预期结结果没有出现现，检查检查 限制酶和DNA浓浓度及纯纯度ž 在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两 个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因 组DNA的浓度和纯度大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA 能产生有效地包装对一个典型的基因组要产生一个 可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06 ž 包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多 而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降 低由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业 性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都 已有商售这种包装提取物质量高，且在体外包装λ 噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。

七)原核生物基因组文库的构建ž1、原核生物基因组的提取ž染色体DNAž质粒DNAž要求：制备的DNA的长度为100-200kbž防止在制备过程中的机械断裂2、酶切片段与载体连接 ⑴酶切片段及分离、纯化 基因组的不完全酶切 ž ①根据实验需要选择合适的限制性内切酶—四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256—六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 ž ②分离目的酶切片段大小的确定—克隆单个基因：< 10 kb—克隆基因族：< 20kb ž ③DNA不完全酶切条件的确定—确定限制酶用量，改变酶切时间—固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切酶切片段回收ž 低熔点琼脂糖回收目的片段 ž 试剂盒回收目的片段⑵酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择： ž 质粒载体可承载15kb DNA左右片段 ž 载体可承载25kb DNA左右片段 ž Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段 3、重组DNA转化受体细胞 ⑴根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 ž 常见的宿主细胞：DH5、HB101、JM101、JM109 ⑵重组质粒转化受体细胞 ž 1）转化法(transformation) ž 2）转染法(transfection) ž 3）转导法(transduction)4、基因组DNA文库克隆子保存与筛选 ⑴基因组DNA文库的保存 ①文库在液体培养基中扩增保存 ž方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转 入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长 数代后，其培养物于-80℃储存（加终浓度为 25%的甘油）。

ž缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库 中某些特定的序列过多或过少②保存单个克隆子于含有甘油的培养基中ž 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗 生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终 浓度为25%的甘油，于-80℃保存ž 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大ž ⑵基因组文库的筛选ž 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选ž 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长ž 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选ž 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选ž PCR筛选法：根据保守序列合成引物,扩增特异性片段从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知识密切相关目的基因的背景知识包括：ž目的基因的部分或全部碱基序列已知ž目的基因编码产物的结构或功能已知ž目的基因与某些生物表型的相关性已知八)用λ噬菌体载体构建基因组文库的步骤ž ①准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右 两臂ž ②纯化真核细胞高分子质量DNA，并用适当的限 制性内切核酸酶部分消化。

ž ③分离适当大小的基因组DNA片段(20-24kb)ž ④连接载体与外源DNAž ⑤连接产物体外包装及感染ž ⑥基因组文库的扩增基因组文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装三、cDNA文库构建ž 真核生物基因组大，结构复杂，含有大量的非 编码区、内含子和重复序列等，直接利用基因 文库很难分离得到目的基因即使分离到DNA 片段，也要同cDNA序列进行比较 ž mRNA是基因转录加工后的产物，且只在特定 组织器官和发育时期表达因此，从cDNA克隆 文库分离基因更具优势此外，mRNA决定了功能蛋白质的初始肽链的翻译，可以用来研究 蛋白质的功能一)cDNA文库的特征ž 从cDNA文库获得的是已经过剪接、去除了内含子的 cDNA,它不含真核基因的间隔序列及调控区, 只反映 mRNA的分子结构，并不是真正意义上的基因ž cDNA文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因ž 基因总量少，显然比基因组DNA文库小得多，很容易 从中筛选克隆得到细胞特异表达基因 ž cDNA文库是有时效性的，文库构建时的信息供体是 某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上 反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或 器官)在某种环境条件下的基因表达情况并不能包括 该生物有机体的全部。