第三章蛋白质化学2.ppt

第三章 蛋白质化学,2,3.3 肽（peptides）,3.3.1 几个相关的概念,肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物组成肽的氨基酸单元称为氨基酸残基肽与氨基酸残基：,肽键(peptide bond):是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰胺键3,由两个氨基酸残基组成的肽称为二肽(dipeptide)；由三个以上十个以下氨基酸残基组成的肽称为寡肽(oligopeptide)；由多个氨基酸组成的肽则称为多肽(polypeptide), 亦称多肽链二肽，寡肽与多肽：,注：肽链可以是链状、环状或分支状4,肽键的特点,＊ 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用＊ 组成肽键的原子处于同一平面＊ 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转＊ 在大多数情况下，以反式结构存在＊ 在细胞内环境条件下，肽键相对稳定,5,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端肽链书写方式：N端→C端,肽链的N-端与C-端：,氨基酸顺序：,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序，氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。

6,上述五肽可简写表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,肽链的表示法(简写)及命名,7,,多肽与蛋白质,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大8,3.3.2 肽的理化性质,(1)．两性解离与等电点,肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓R基的pK变化不大肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值9,,(2)．肽的旋光性及紫外吸收 肽具有旋光性，短肽的旋光度等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度之和；长肽的旋光度比累加的和小很多 肽在紫外吸收区215nm处有最大吸收峰，可以用来作为肽的定量测定10,（3）肽的化学性质,肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应。

a）双缩脲反应,（b）茚三酮反应 肽与茚三酮反应不放出CO2肽和蛋白质特有，用于肽和蛋白质的定量测定11,3.3.3 天然存在的某些活性肽,(1) 肌肽和鹅肌肽,肌肽（carnosine）:β-Ala-His,鹅肌肽（anserine）：β-Ala-1-Me-His,12,(2) 谷胱甘肽(glutathione,GSH),13,GSH具有重要的功能：,1、解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外2、维持红细胞膜的完整性3、参与高铁血红蛋白的还原作用4、促进铁的吸收14,(3) 多肽抗菌素,环链肽,15,(4) 多肽激素,种类较多，生理功能各异多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽） 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等16,垂体后叶激素如催产素和加压素,17,18,(5) 神经肽,甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Met,亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,功能：镇痛,例如脑啡肽 (enkephalin)：,Responsible for signal transduction (信号转导) in neurotransmission 　脑啡肽(enkephalin)；内啡肽(Endorphin)；强啡肽(dynorphin)； P物质 (Substance P)；神经肽Y (neuropeptide Y),19,3.4 蛋白质的分类,3 根据溶解度分类（清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、 精蛋白、组蛋白、硬蛋白）,20,简单蛋白质分类,,只有α- 氨基酸组成。

21,结合蛋白质分类,由单纯蛋白质与非蛋白质物质结合而成22,为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象3.5 蛋白质的结构,23,构象与构型,24,3.5.1 蛋白质结构的近代概念,3.5 蛋白质的结构,25,一级结构(primary structure)：氨基酸序列，肽键相连.高级结构二级结构(secondary structure)：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构， α-螺旋 、β-折叠、β-转角和无规卷曲三级结构(tertiary structure):整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，主要靠次级键（疏水键、离子键、氢键和Van der Walls力维持）四级结构(quaternary structure):蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用（主要靠疏水键维持）,,26,3.5.2 蛋白质结构的研究方法,3.5.2.1 一级结构的研究方法 肽链水解与末端分析法,3.5.2.2 高级结构的研究方法 重氢交换法 核磁共振光谱法 园二色性 荧光偏振法 红外偏振法,27,3.5.3 蛋白质的一级结构（primary structure）,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排列顺序（sequence）。

氨基酸顺序书写时，从 N-末端(N-terminus) 至 C-末端 (C-terminus).,肽键(peptide bond)和二硫键(disulfide bond) 均属于蛋白质一级结构.,28,,1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质Sanger由此1958年获Nobel 化学奖1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素29,Gly,Ile,Val,Cys,Glu,Gln,Ala,Ser,Phe,Lys,Val,Cys,Pro,Arg,Asp,Leu,Tyr,Thr,Asn,Lys,His,Leu,—COO-,H3N+—,,,,SS,30,3.5.3.1 蛋白质一级结构的测定—AA序列的测定,序列测定前的准备工作：,样品的纯度,相对分子质量,肽链的数目,氨基酸组成,一级结构的测定主要用小片段重叠法,原理：,31,（1）末端分析：包括N端分析，C端分析,N端分析方法,① 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）,序列测定步骤与方法,32,② 丹磺酰氯法（DNS法）,33,③ 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ）,34,④ 氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法,Ala,Val,Gly,35,亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP）,专一性:,A=非极性氨基酸时 快,A=其它氨基酸时 慢,A=Leu时 最快,36,① 肼解法：也称联氨法,C端分析,苯甲醛缩合,,,二亚苄衍生物(不溶于水),溶于水,37,C端分析,② 硼氢化锂还原法,38,③ 羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法,39,4种羧肽酶的来源和专一性,40,（2）肽链的拆开和分离与纯化,共价键： 主要是二硫键折分,分离纯化：,采用还原法或氧化法,序列测定步骤与方法,Dialysis (透析)Acetone precipitation and salt precipitation (沉淀)Electrophoresis (电泳)Chromatography (层析)Ultracentrifugation (超离心),41,（3）肽链的氨基酸组成分析,酸水解：通常用6mol/L HCl,HPLC分析AA组成,序列测定步骤与方法,42,（4）肽链的部分水解,化学方法：,溴化氰（CNBr）裂解法:,序列测定步骤与方法,43,酶解方法,44,（5）肽段的分离和氨基酸序列测定,Edman降解（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。

此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离序列测定步骤与方法,45,（6）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列,序列测定步骤与方法,46,（7）二硫键位置的确定,对角线电泳,47,4．蛋白质序列数据库,(1) PIR（Protein Information Resource）数据库,(2) SWISS-PROT数据库,48,3.5.4 蛋白质的二级结构,指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象.,酰胺平面是构成主链构象的基本单位定义：,49,3.5.4.1肽键平面(或称酰胺平面,amide plane),在肽链中每6个原子C-C(=O)-N(-H)-C构成一个肽单元;Pauling等人对一些简单的肽及氨基酸的酰胺等进行了X射线衍射分析，得出下图所示结构：,50,(1)肽键中的C-N键长0.132nm，比相邻的N-C单键(0.147nm)短，而较一般C=N双键(0.127nm)长，可见，肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间，具有部分双键的性质，因而不能旋转，这就将固定在一个平面之内酰胺平面的特性,51,,(2)肽键的C及N周围三个键角之和均为360°，说明都处于一个平面上，也就是说六个原子（-Cα—CO—NH—Cα-）基本上同处于一个平面，这就是肽键平面(或酰胺平面).参与肽键的6个原子:-Cα-CO-NH-Cα- 称为肽单元(peptide unit)；(3)肽链中能够旋转的只有α碳原子所形成的单键，此单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系，于是肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。

4)肽键中的C-N既具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实CO和NH处于反位52,,,,,,,,,,,,,,,C,,,,,,,,,,,,,Cα3,Cα2,Cα1,C,N,N,H,H,H,O,O,R,酰胺平面 1,酰胺平面 2,肽单元及其旋转,,ψ,,Φ,53,Trans and cis peptide bonds. The trans form is strongly favored because of steric clashes that occur in the cis form.,反式（Trans）,顺式（cis）,54,3.5.4.2  -螺旋(α- helix),1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了α-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在α-螺旋定义：蛋白质分子中局部肽链的肽平面通过α碳原子旋转，使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象.如： α角蛋白（皮肤、毛发、指甲、和角）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0.54 n m 3.6个残基,,,0.15 n m,,,,,55,① 蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100º。

（=-57º,  =-47º）；,。