内蒙古大学环境微生物学讲义06微生物的生长繁殖与生存因子.docx

第六章 微生物的生长繁殖与生存因子第一节 微生物的生长繁殖与分离培养概述：在适宜的环境条件，微生物不断吸收营养物质并进行新陈代谢，如果同化作用在于异化作用，细胞质量会不断增加，于是表现为生长（有机体量的增加），微生物学中的生长多指群体生长细菌以二等分裂方式（1→2→4）分裂，细菌的生长为指数生长群体细胞数目加倍所需的时间为倍增时间（td），倍增时间的长短取决于微生物的生长速率，培养基组成和环境条件Ecoli的倍增时间在适宜条件下大约为20钟细菌在液体培养基中遵循典型模式规律生长，称为细菌生长曲线，可划分为延迟期，指数（生长）期，平衡期和衰老期所用的研究技术称为分批培养(batch culture)(单批培养)分批培养时会由于营养物耗尽和有毒代谢物积累，最终细胞生长下降假如用新鲜培养基置换用过的培养基，细胞就能保持某一恒定生长速率，这种技术叫连续发酵）研究微生物的群体生长规律，首先要获得纯培养一、纯培养的分离方法微生物在自然界常混杂地生活在一起；如土壤就是微生物的大本营当我们需要利用或研究某一种微生物时，就把它们分离开，从而得到纯培养所谓纯培养就是单一细胞繁殖得到的后代最常用的分离方法有稀释培养法，平皿划线法、单细胞排取法和选择培养基分离法。

1．稀释培养法这是最常用的纯培养获得方法，也用于菌种分离和环境微生物计数首先获得合适的稀释液→平皿接种（摇和、涂皿）→保温培养→形成菌落 2．平皿划线分离法首先制备无菌平板，将培养物在培养基表面连续划线，微生物逐渐分散、经保温培养后就可得到单一菌落反复2—3次可得到纯培养 3．选择培养基分离法利用某些抑制因子将不需要的微生物排除（不能生长），适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择性培养基如固N微生物、营养缺陷型菌株的筛选等另外，环境研究中常用加富培养基（加特定污染物）获得降解菌 4．单细胞挑取法直接从样品中挑取某一细胞从而获得纯培养具体方法是用安装在显微镜上的极细的毛细吸管完成，如孢子分离多限于专业化的科研中如菌根真菌孢子的挑取，但其需活体培养题：欲对一污水样（土壤样）中的微生物进行计数和分离，请你设计一个具体方案，得到各类群微生物的数量值。

二、研究微生物生长的方法 （一）单批培养（分批培养）用来描述微生物的群体生长规律，——典型生长曲线首先我们把少量细菌纯培养接种到恒容积的液体培养基中，适宜条件下，它们会呈现有规律的生长过程如以细胞数目的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标就可画出一条有规律的曲线——即典型生长曲线growth curve)生长曲线是细菌在新的适宜条件下生长繁殖直至衰老死亡过程的动态曲线，根据生长速率的不同一般分为四个阶段：1.延迟期 2.指数期 3.稳定期 4.衰亡期 1．延迟期（lag phase） 也称停滞期，适应期少数细菌接种到新鲜培养基后，一般不能立即进行繁殖特点是分裂迟缓，调节代谢原因可能是调节胞内酶的种类以适应新环境根据菌种的不同，延迟期从几分钟到数小时不等 2．指数期（对数期exponential phase）随后细胞逐渐进入一个以几何级数增长的一段时期特点是生长快速，代谢旺盛 在这个阶段，细胞的代时（增代时间generation tine）最短对单细胞微生物来说，几表示细胞分裂的次数，则分裂后细胞中数目应为20、21、22、…2n，即X2 = X12n.在对数期中，有三个参数常被用在生产实践中：代数（n），代时（G）和生长速率（R）。

1．繁殖代数（n）从右图可见， x2 = x,·2n 取对数表示：eyx2 = egx1 + neg2 ∴ n = (egx2－egx1)/eg2 = 3.322eg x2/x1 2．生长速率常数（R） 按定义（每小时分裂代数）： R = n/t2－t1 =2.32(egx2/x1)/t2－t1 3．代时（G） 即增代时间，按平均代时定义（细胞分裂1次所需时间）t2－t23.32egx2/x1t2－t1 n G = 1/R = = * 例题：某发酵生内大肠杆菌接种时的细胞浓度为100个/ml，经400分钟培养，细胞浓度增至10亿个/ml，求该菌的世代时间G和繁殖代数n 已知：t1 = 0 x1 = 102 t2 = 400 x2 = 109 n = 3.3(eg109－eg102) = 3.3 × 7≈23(代) 400－0 23 G = = 17.3（分钟） 即上述培养物中，E.coli 代时为17.3分钟，繁殖了23代。

各种微生物的代时（增代时间）是不同的，如飘浮假单胞菌只需9.8分，而活跃硝化杆菌则需1200小时但多数细菌在10-30分钟影响指数期代时长短的主要因素有：（菌种 T、生长因子、营养物等） ①菌 种 遗传和代谢特性所决定期②培养温度 取决于最适生长温度，多数30—40℃，寄生型37℃③营养物浓度 特别是生长限制因子（指处在较低浓度范围，可影响菌体生长速率的营养物）浓度④营养物成分 营养丰富的培养其中代时较短如E.coli (肉汤17min，牛奶12.5min)处于指数期的微生物代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，发酵工业中常利用该阶段微生物作为种子 3．稳定(Stationary phose) 也叫静止期，最高生长期或平衡期特点是净生长速率R = 0 ，即新生的和衰亡的菌体数处于动态平衡之中，菌体产量达到最高点该期中菌体产量和营养物消耗量间呈现一定的比例关系，在生长上称为产量常数（Y） Y = 菌体生长量/营养物消耗量〔（x1－x0）/(ct－60)〕 例如：产黄青霉在合成培养基上生长时，Y = 1/2.56，即每合成1g菌上体干重需消耗2.56g葡萄糖进入稳定期，细胞开始形成糖原等贮藏物，有的合成抗生素等次级代谢产物。

稳定期到来的原因主要是生产限制因子的不足，其次营养比例（如C/N）失调、有害代谢产物（如酸、毒素繁）也是相关因子 4．衷亡期（decline phase） 当个体死亡速度超过新生速度，整个群体出现负生长，R

在微生物工业中，为了获得大量菌体或相应代谢产物可利用恒浊器 2．恒化器（Chemostat） 恒化连续培养是以特定的流速维持营养成分的培养方式控制指标是营养物（多指生长限制因子）的量以上连续培养如用于生长产，称为连续发酵它具有高效，可控、经济及质量稳定的优点但要防止菌种退化和杂菌污染的问题连续发酵的时间多为数个月在污水生物处理体系中，除序批式间歇曝气器（SBR）法外，均采用恒化连续培养的原理活性污泥中微生物的生长规律与分批培养时的规律不一样，它只能是典型生长曲线的某一生长阶段（如下面方法分别采用稳定期，对数期微生物）；①常规的污水处理方法（活性污泥，生物吸附法）一般利用静止（稳定）期微生物②高负荷活性污泥法利用对数期的微生物，这时微生物代谢旺盛，生长繁盛殖快，能大量去除有机物因此要求进水的有机物浓度高，相应的不易达到排放标准；又由于该期微生物生长快，尚未形成荚膜及菌胶团，不易沉淀，致死出水水质差③用延时曝气法处理低浓度有机废水时（BOD5/COD<0.3），多利用衰亡期微生物，通过延长曝气时间（>8h），即利用内源呼吸的微生物达到处理效果原因是低浓度有机物·满足不了静止期微生物的营养要求。

三、微生物生长量的测定方法微生物生长量包括微生物数量和生物量，测定方法很多，真接测定可根据菌体数量，体积或质量来确定，间接测定可根据细胞物质含量、代谢活动强度、DNA 或 16SrRNA的多态性等下面介绍几种测定方法： 1．微生物生物量（MB） 1）重量法：适用所有微生物尤其是丝状微生物首先取定量菌悬液→离心（过滤）→恒重的蒸发器→烘干称重细菌菌体的平均干重是0.26×10-12g2）细胞组分法（生理指标法）：与生长量正相关的生理指标很多，如ATP、DNA、RNA含量，工业上常采用耗糖量或耗氧量此外MB-C（－N）常被采用，方法有熏蒸浸提法（CFE）或培养法（CFI） 2．微生物数量 1）总菌数 ①直接计数法，如血球计数板法（r = 0.1mm3） ②涂片计数法，取定量菌悬液→涂片（载玻片1cm2）→温热固定→染色→镜下计数→换算的总菌数2）活菌数 ①平板菌落计数法：单位是CFU，是最常用的活菌计数法，适用于不同类群微生物的分离和计数，水和土壤等环境中微生物的数量主要采用该法，培养基为选择性培养基为主，操作步骤同纯培养的稀释平板法，关键是选择合适的稀释度和树立无菌概念。

②比浊法：用比浊计或分光光度计在可见光（450—650nm）处测定，再根据预先绘声绘制的标准曲线查得菌液浓度，工业上多用N = Ax + b细胞数目吸克度第二节 微生物的生存因子（与环境因素的关系）微生物除了需要营养外，还需要合适的环境生存因子例如T. PH. O2. 渗透压、光照等各种环境因素如果环境条件不正常，就可能影响微生物的生命活动，甚至发生变异和死亡一、温度任何微生物只能在一定的温度范围内生存，在适宜的温度范围内，每升高10℃，酶促反应速度可提高1～2倍，微生物的代谢速率和生长速率可相应提高根据微生物的最适生长温度，可将微生物分为三类：低温性微生物（嗜冷菌） 5～10℃ 其最低和最高 中温性微生物（嗜中温菌）25～40℃ 温度约±20℃ T对R的影响生长速率TR最适最低最高高温性微生物（嗜热菌） 50～60℃ 多数微生物的最适生长温度（培养温度）采用30±2℃，寄生菌采用37℃嗜热菌是特殊的微生物，如芽孢杆菌和嗜热古菌，凡在55～7。