抗生素微生物检定法(实习总结).doc

抗生素微生物检定学习报告及总结抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的 90%或高于估计效价的 110%时，应调整其估计效价，重新试验除另有规定外，本法的可信限率不得大于 5%管碟法（二剂量）测定抗生素的效价管碟法（cylinder plate method）是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管,管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价1 实验材料1.1 实验试剂抗生素检定培养基Ⅱ号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、0.9%灭菌生理盐水1.2 实验菌株及样品菌株为藤黄微球菌菌悬液，样品为车间生产的酒石酸泰乐菌素干粉1.3 实验仪器及设备玻璃烧杯、容量瓶、直径90mm 的玻璃培养皿、刻度吸管、移液管、胶头吸管、不锈钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、镊子、菌株培养茄瓶、三角烧瓶、温度计、多功能微生物自动测量分析仪、微波炉、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、2 实验方法2.1 实验用菌株制备提前将藤黄微球菌接种于茄瓶斜面培养基，置30℃左右温箱培养2～3天后取出放4℃储存。

用时取出茄瓶于无菌环境下无菌操作，向茄瓶内加入5ml 0.9%灭菌生理盐水，轻轻摇动茄瓶，将斜面细菌洗下制备成一定浓度的菌悬液（浓度大小以最终产生的抑菌圈大小在16～18mm 之间而定）2.2 抗生素检定培养基的配制准确称取抗生素检定培养基Ⅱ号26.5g 倒入三角烧瓶中，加入1000ml 纯化水，混匀后塞上塞子，以牛皮纸包扎后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用2.3 pH 6.0磷酸盐缓冲液的配制用托盘天平称取磷酸氢二钾20g、磷酸二氢钾80g 于1000ml 三角烧瓶内，加入1000ml 纯化水，搅拌溶解，混匀后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用2.4 标准品溶液和供试品溶液的配制标准品溶液：精密称取泰乐菌素标准品50mg，于小烧杯内用灭菌的 pH 6.0磷酸盐缓冲液溶解，溶解液转入50ml 容量瓶中（烧杯冲洗3次），定容后制成1000u/ml 的标准液置4℃冰箱备用用时根据需要稀释成100u/ml、10u/ml、5u/ml 的不同浓度（采用两步稀释法）供试品溶液：精密称取酒石酸泰乐菌素供试品50mg，同标准品同法溶解制成终用的10u/ml、5u/ml 两个浓度的溶液2.5 实验过程（1）于半无菌间内制备检测用碟子：拿出配置好的培养基，取20ml 加入到无菌平皿内，凝固后作为底层培养基。

2）用无菌刻度吸管吸取2ml 藤黄微球菌菌悬液，加入到500ml 48～50℃培养基内，摇匀后迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，作为菌层培养基3）于平皿内均匀放置4（二剂量法）或6（三剂量法）个小钢管，各钢管之间尽量等距4）点样：按照下图分别向钢管内加入标准液和供试液，每个供试品做8个平行同时设立阴性和阳性对照阴性对照的4个钢管内加样为 pH 6.0灭菌磷酸盐缓冲液和高低浓度的标准溶液，阳性对照的4个钢管不加样B1：标准品低浓度溶液 T 1：供试品低浓度溶液B2：标准品中浓度溶液 T 2：供试品中浓度溶液B3：标准品高浓度溶液 T 3：供试品高浓度溶液（5）点样结束后，盖上陶瓦盖，将碟子平稳放置于35～37℃恒温培养箱内培养15～18小时即可取出测量6）于多功能微生物自动测量分析仪上测量抑菌圈大小，并出结果，记录B3B1Y1Y3B3B2B1Y3Y1Y2二剂量法计算公式： %10log121ISTP三剂量法计算公式： l 1321 IP 为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）S1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和S2为标准品中浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和S3为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T2为供试品中浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T3为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和I 为高低浓度剂量之比的对数值3 结果判断3.1 可靠性测验 管碟法系根据量反应平行线原理儿设计，并要求在实验所用的剂量（浓度）范围内，对数剂量与反应呈直线关系。

可靠性测验即通过对剂间变异的分析，一测验标准品和供试品的对数剂量与反应的关系是否显著偏离平行直线用抑菌圈测量仪测量抑菌圈是，测量与统计学处理一次完成，统计学分析按药典附录的生物机电统计法进行 F 的显著性测验要求直线回归和剂间要非常显著（P0.05），二次曲线和反向二次曲线均应不显著（P>0.05），符合以上规定，才能认为实验结果可靠，方可进行效价和可信限率计算3.2 可信限率考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，管碟法的可信限率不的超过5%上述各项都能符合，试验结果成立3.3 试验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结 果仅作为初试，应调整供试品效价，予以重试纯化水微生物限度检定实验（薄膜过滤法）采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大一0.45μm，选择滤膜材质是应保证供试品机器溶剂不影响微生物的充分节流滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性水溶性公式也过滤前现将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。

总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤1 实验材料1.1 实验样品 取自各个采样点的纯化水1.2 实验试剂pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基均按照说明配制后经115℃，30分钟高压蒸汽灭菌后备用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌前即分装100ml 三角烧瓶内，每瓶装90ml1.3 实验用具0.45μm 孔径滤膜（用多少取多少）、过滤器、镊子及所有用具均采用湿热灭菌方式121℃，15分钟进行灭菌，并保证滤膜在使用前后的完整性1.3 培养皿的制备 进入微生物限度检定室以75%酒精或者0.2%新洁尔灭溶液擦拭清洁后，开紫外照射灭菌30分钟，使用时提前10分钟关掉紫外，开风机吹一会配制并灭菌好的培养基及其它用具一律经传递仓传递入无菌室内于无菌操作台上向培养皿内加入20ml 左右的培养基，水平放置待冷却凝固后用于实验2 实验过程以下实验操作均在严格的无菌环境进行，所以进入后要着无菌服，并用酒精棉球严格擦拭手部1）安装过滤器，装上滤膜，取少量 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液湿润滤膜2）打开预先准备的盛有90ml pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的烧瓶，取10ml 样品纯化水，，振摇混匀后取10ml 过滤膜，真空泵抽滤过滤，再以100ml pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗一次。

3）用无菌镊子轻轻取下滤膜菌面朝上贴于准备好的培养基上每个样品做一个培养皿4）以 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤膜作为阴性对照5）同时设立阳性生长菌对照金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、黑曲霉菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌6）平皿放置在30～35℃生化培养箱内培养3天后进行观察和计数3 结果观察及判定取出培养皿，记录滤膜上生长的菌落数每个滤膜上的菌落数不得超过100个，细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml 不得过100个为符合规定菌数报告原则：以相当于1ml 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数藤黄微球菌冻干管的复活和菌种的传代1 准备工作1.1 将镊子、胶头滴管、生理盐水、接种环等物品经121℃，15分钟高温灭菌后放入无菌室内的净化操作台上1.2 制备营养头汤培养液和营养琼脂培养基茄瓶斜面，均经115℃，30分钟高压灭菌后备用1.3 将准备好的酒精灯、酒精棉球瓶、记号笔等用品放入无菌室2 操作过程2.1 冻干管的复活（1）用消毒液浸泡过的丝光毛巾擦拭无菌室的净化工作台面积里面的物品擦拭结束后开启净化工作台系统和紫外，照射30分钟对环境进行灭菌，关闭紫外，打开照明灯，等待10分钟。

2) 进入操作，并将藤黄微球菌冻干管带入无菌室用75%酒精棉球擦拭手部及冻干管3)点燃酒精灯，于靠近火焰处打开盛有生理盐水和灭菌水的试管及营养肉汤的三角瓶4）将冻干管的封口一段在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取灭菌水滴在灼热的冻干管封口一端使骤冷而炸裂5）另取滴管吸取灭菌的生理盐水加至冻干管底部，将冻干管内菌块溶解，随即吸出管内菌液加入到营养肉汤内，塞好棉塞，用牛皮纸包扎后放入无菌间内的培养箱以29℃，培养15～18小时6）培养过程中观察营养肉汤菌瓶是否混浊2.2 细菌的传代（接种于茄瓶斜面）取出之前复活的细菌营养肉汤培养液于无菌操作下以接种环接种于茄瓶营养琼脂培养基斜面斜面反放置于培养箱内培养2～3天后放入0～5℃冰箱保存备用学习感受1、运用管碟法进行生效测定时固体样品的称量和各步溶液的吸取都要非常精确，否则会影响实验的精密度，即影响剂量和剂间比的变化，从而影响最终的测定结果2、培养平皿制备时菌层的加入要迅速而准确慢了，培养基凝固快造成表面不平整，量不准确会影响抑菌圈的大小，从而影响实验结果3、目前实验流程能基本完成，熟练度仍有待加强结果分析方面需要培养4、下一步要在药品检验相关基础知识方面加强学习了解。