实验一---高压蒸汽灭菌锅的使用和.doc

实验一 高压蒸汽灭菌锅的使用和玻璃器皿的洗涤、包扎及灭菌一、实验要求：1、熟悉微生物实验所需的各种常用器皿名称和规格2、掌握对各种器皿清洗方法3、掌握玻璃器皿的干热灭菌操作过程 4、了解手提式高压蒸汽灭菌锅的结构、使用方法和操作要点；二、材料：1、常用各种玻璃器皿2、清洗工具和去污粉、肥皂、洗涤液3、电热干燥箱三、概述：为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎试管和三角瓶要做棉塞这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败因此应看作是微生物实验的基本操作四、方法：（一）器皿洗涤的注意事项和方法：1、任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，所以不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿2、一般新的玻璃器皿用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充洗干净3、用过的器皿应立即洗涤，有时放置太久会增加洗涤困难4、难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起有油的器皿不要与无油的器皿放在一起，否则使本来无油的器皿也沾上了油垢，浪费药剂和时间5、强酸、强碱、琼脂等腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废缸内。

6、含有琼脂培养基的器皿，可先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮去，或把它们用水蒸煮，待琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤7、一般的器皿都可用去污粉、肥皂或配成5%热肥皂水来清洗油质很重的器皿，应先将油层擦去8、如果器皿沾有煤膏、焦油及树脂类的一些物质，可用浓硫酸或40%的氢氧化钠液洗，或用洗涤液浸泡9、当器皿上沾有蜡或油漆等物质，用加热方法使之融化揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、丙酮、松节油等）拭揩10、洗涤后的器皿达到玻璃能被水均匀湿润而无条纹和水珠11、载玻片或盖玻片可先在2%盐酸溶液中浸1小时，然后在水中冲洗2~3次，最后用蒸馏水洗2~3次，洗后烘干冷却或浸于95%酒精中保存备用用过的载玻片或盖玻片，先擦去油垢，再放在5%肥皂水中煮10分钟后，立即用清水冲洗，以后放在洗涤液（稀释）中浸泡2小时，再用清水洗至无色为止，最后用蒸馏水洗数次，干后浸于95%酒精中保存备用12、凡遇有传染性材料的器皿，洗涤前应经高压灭菌后清洗二）器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎1、养皿 洗净烘干后每10套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。

2、吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉每支吸管用一条宽约4~5厘米，以45°左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管（图见下页）3、试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口（见下页图）若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞合格的棉塞 不合格的棉塞（三）灭菌使玻璃器皿达到无菌状态叫灭菌，玻璃器皿主要用电热干燥箱进行灭菌1、燥箱灭菌的物品放在箱内，堆置时要留空隙勿使接触四壁，关闭箱门。

2、接通电源，把箱顶的通气口适当打开，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100℃时关闭3、调节温度控制器旋扭，直至箱内温度达到所需温度为止，观察温度是否衡定，若温度不够再行调节，调节完毕后不可再拨动调节旋扭和通气口，保持140~160℃ 2~3小时4、切断电源，冷却到60℃时，才能把箱门打开，取出灭菌物品5、将温度调节控制旋扭返回原处，并将箱顶通气口打开所有空箱，干净的玻璃器皿及其它耐热器皿等一般都可用此法灭菌如培养基和其它不耐热的橡皮塞等不可用此法灭菌五、用手提式高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103－206kPa时，湿度可达121.3-132℃高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌，为目前可靠而有效的灭菌方法适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等　　潜热是指当lg100℃的水蒸汽变成lg100℃水时，释放出2255.2J的热量　　高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。

图5－1　手提式高压蒸汽灭菌器　　手提式高压蒸汽灭菌器（图5－1）：为金属圆筒，分为二层，隔层内盛水，有盖，可以旋紧，加热后产生蒸汽锅外有压力表，当蒸汽压力升高时，温度也随之相应升高该灭菌器体积小，可自发蒸汽，便于携带　　操作方法如下：在灭菌器中盛水3000ml；将拟灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内；将盖子上的排气软管插于铝桶内壁的的方管中；盖好盖子，拧紧元宝螺丝，勿使漏气；锅下加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气10－15分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3℃,维持20分钟后，排气至“0”时，慢慢打开盖子如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂　　卧式高压蒸汽灭菌器（图5－2）；其结构原理同手提式高压蒸汽灭菌器，因其体积大，一次可灭菌大量物品操作人员须经专业培训，合格后方能上岗图5－2　卧式高压蒸汽灭菌器　　后再关闭放气开关，待夹层压力表达到灭菌所需压力时（约10分钟后），将蒸汽控制阀移至“消毒”位置，使蒸汽进入柜室，柜室内的冷空气及冷凝水可由柜室阻气器排出，待柜室的压力升到103－137kPa，温度达121.3～126.2℃时，转动压力调节阀，使压力与温度保持恒定。

维持30分钟后，将蒸汽控制阀移至“排气”位置，排气毕，将蒸汽控制阀移至“干燥”位置；物品干燥后，将蒸气控制阀移至“关闭”位置，待压力指针到“0”位置和热空气排尽后，才能打开柜门，取出物品；关紧进气阀　　预真空式高压蒸汽灭菌器（图5－3）；在通入蒸汽前有一预处理阶段，即柜室内抽负压至2.6kPa（空气排除约98％），所以，预真空高压蒸汽灭菌器除有下排气式所具备的灭菌系统、蒸汽输送系统、控制系统、安全系统和仪表监测指示系统外，增加抽负压系统和空气过滤系统机器运转由电脑控制图5－3　预真空高压蒸汽灭菌器　　预真空式高压蒸汽灭菌器湿度可达132－135℃，具有灭菌周期快、效率高，完成整个灭菌周期只需25分钟，节省人力、时间和能源；冷空气排除较可靠与彻底；对物品的包装、排放要求较宽，而且真空状态下物品不易氧化损坏的特点但设备费、维修费较高，对柜体密封性要求较高，漏气量每分钟不得使负压升高值超过0.13kPa存在小装量效应，即欲灭菌物品放得过少，灭菌效果反而较差小装量效应的发生主要由于物品体积愈小，在柜内残留空气愈多，对蒸汽接触物品的阻隔作用愈大所致，瓶装液体不用此法灭菌　　操作方法如下：打开蒸汽管道阀门，首先将柜室夹层和管道内的空气和积水排净，使夹套内达到预定压力和温度（104－167℃），将待灭菌物品装入柜室，关紧柜门。

柜室内抽负压至2.6kPa，向柜室内输入蒸汽，将控制阀移至“消毒”的位置随后机器按一定程序自动运行，诸如：“恒温”、“排气”、“干燥”、“关闭”等待恢复常压后打开柜门取出物品灭菌时使压力达206kPa，温度为132℃，维持4－5分钟　　高压蒸汽灭菌法的注意事项：　　第一，无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态　　第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果　　第三，定期检查灭菌效果经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜　　高压蒸汽灭菌效果的监测：有以下三种方法　　第一种是工艺监测，又称程序监测根据安装在灭菌器上的量器（压力表、温度表、计时表）、图表、指示针、报警器等，指示灭菌设备工作正常与否此法能迅速指出灭菌器的故障，但不能确定待灭菌物品是否达到灭菌要求此法作为常规监测方法，每次灭菌均应进行.　　第二种是化学指示监测。

利用化学指示剂在一定温度与作用时间条件下受热变色或变形的特点，以判断是否达到灭菌所需参数常用的有：　　自制测温管：将某些化学药物的晶体密封于小玻璃管内（长2cm,内径1～2mm）制成常用试剂有苯甲酸（熔点121－123℃）等灭菌时，当湿度上升至药物的熔点，管内的晶体即熔化，事后，虽冷却再凝固，其外形仍可与未熔化的晶体相区别，此法只能指示温度，不能指示热持续时间是否已达标，因此是最低标准主要用于各物品包装的中心情况的监测　　3M压力灭菌指示胶带：此胶带上印有斜形白色指示线条图案，是一种贴在待灭菌的无菌包外的特制变色胶纸其粘贴面可牢固地封闭敷料包、金属盒或玻璃物品，在121℃经20分钟，130℃经4分钟后，胶带100％变色（条纹图案即显现黑色斜条）3M胶带既可用于物品包装表面情况的监测，又可用于对包装中心情况的监测，还可以代替别针，夹子或带子使用　　第三种是生物指示剂监测利用耐热的非致病性细菌芽胞作指示菌，以测定热力灭菌的效果菌种用嗜热脂肪杆菌，本菌芽胞对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽胞相似生物指示剂有芽胞悬液、芽胞菌片以及菌片与培养基混装的指示管检测时应使用标准试验包，每个包中心部位置生物指示剂2个，放在灭菌柜室的5个点，即上、中层的中央各一个点，下层的前、中、后各一个点。

灭菌后，取出生物指示剂，接种于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，置55－60℃温箱中培养48小时至7天，观察最终结果若培养后颜色未变，澄清透明，说明芽胞已被杀灭达到了灭菌要求若变为黄色混浊，说芽胞未被杀灭，灭菌失败图5－4　高压蒸汽灭菌指示带图5－5　高压蒸汽灭菌化学指示卡四、 实验作业：附：1、常用玻璃器皿：量筒、三角瓶、试管、培养皿、漏斗、玻棒、吸管、防水油纸2、洗涤液：浓配方：重铬酸钾（工业用） 40.0克蒸馏水 160.0毫升浓硫酸（粗） 800.0毫升稀配方：重铬酸钾（工业用） 50.0克蒸馏水 850.0毫升浓硫酸（粗） 100.0毫升配法：将重铬酸钾溶解在蒸馏水中（可加热），待冷却后，再慢慢地加入浓硫酸，边加边搅拌，配好后存放备用此液可使用很多次，每次用后倒回瓶中贮存，直至洗涤液变成青褐色时才失去效用器皿上有大量有机质时，不可直接用洗涤液来洗涤，应尽量先行清除后再用，否则洗涤液很快会失败洗涤液不能用手洗涤金属器皿，洗涤液有强腐蚀性，如溅于桌椅上，应立即用水冲洗，然后用碳酸钠溶液或氨水洗。