上海交大 中文翻译 生物化学课本：第5章基因和基因组的研究方法.pdf

旗开得胜 读万卷书 行万里路 1 第五章 基因和基因组研究技术 从 caterpillar 发展成蝴蝶， 基因表达谱发生了一系列显著变化 用 DNA 芯片能同时检测成 千上万个基因的表达水平右边是一张基因芯片，显示人的 12000 多种基因表达水平每 个点的量度表示该基因的表达强度 自从 1970 年代出现 DNA 重组技术以来，重组 DNA 技术给生物化学带来了革命性进 步 生物个体的遗传特征能够根据人类设计加以改造 重组 DNA 技术是人类对 DNA， RNA， 和病毒研究进行了几十年研究的结晶 该技术取决于酶切、 连接、 和复制 DNA 的酶和 RNA 反转录限制性内切酶能够将很长的 DNA 分子特异断裂成易于操作的 DNA 片段；DNA 连接酶能够将 DNA 片段连接现在已经有很多限制性内切酶采用这种技术，研究人员能 够将将 DNA 片段从一个 DNA 分子转移到另一 DNA 分子中因此重组 DNA 技术的基础 是核酸酶学 第二个基础是碱基配对， 即序列互补的核酸链相互间自动识别、 自动结合形成核酸双链 旗开得胜 读万卷书 行万里路 2 用互补 DNA 或 RNA 探针杂交检测特异核酸序列灵敏度高。

在重组 DNA 技术中，碱基配 对用于重组 DNA 构建、检测和扩增特异核酸序列重组 DNA 技术也依赖病毒病毒能有 效地将自身 DNA(或 RNA)供应宿主，挟持宿主复制病毒基因组、合成病毒蛋白质，或将病 毒 DNA 整合到宿主基因组中 质粒是细菌染色体外的遗传物质， 这种遗传物质对重组 DNA 技术而言也是不可或缺的 第三，已经建立了非常有效的 DNA 序列测定技术这些技术能够测定全基因组序列 最先测定的是病毒基因组，随后是更长的细菌基因组，最后测定的是真核基因组，包括 30 亿碱基对长的人类基因组科研人员正在开始探讨这些基因组序列的海量信息 这些新技术极大地促进了相关领域的科学研究即可以在天然环境中、也可以在其它条 件下研究某个基因或基因产物的作用 以某种方式改造基因， 制造变异蛋白质能够详细了解 蛋白质的功能重组 DNA 技术能够制造临床上有用的蛋白质，如激素；也能用来制造耐受 病虫害或恶劣生长环境的农作物重组 DNA 技术提供的这些机会将产生更大的影响 旗开得胜 读万卷书 行万里路 3 5.1 基因研究的关键工具 生物技术的迅猛发展实际上是几个关键技术的产物 1. 限制性内切酶分析。

限制性内切酶是精确的剪切 DNA 分子的手术刀，使研究人员能够 操纵 DNA 片段 2. 印迹技术Southern blots 和 Northern blots 能分别用来分离和鉴定 DNA 和 RNA 在前面介绍的 Western blots 采用抗体鉴定蛋白质 3. DNA 序列测定该技术能够测定 DNA 分子的碱基序列DNA 序列测定产生了大量的 信息，这些信息涉及基因结构、基因表达调控、和蛋白质结构 4. 核酸固相合成能够化学合成所需序列的核酸分子用于鉴定或扩增其它核酸 5. 聚合酶链式反应(PCR)PCR 能使特定 DNA 片段扩增上十亿倍PCR 反应能够将一个 DNA 分子扩增到足以进行 DNA 鉴定和操作的产量该技术用于病原体鉴定和遗传病 诊断、确定犯罪现场毛发来源、复活化石的基因 6. 最后的一套技术依赖计算机，将在第 6 章介绍没有计算机技术，我们不可能对大量 信息（尤其是 DNA 序列信息）进行分类、检索、和鉴定而这些信息就是用前面提到 的那些技术获得的 限制性内切酶能够将 DNA 分子断裂成特异片段 限制酶也叫限制性核酸内切酶， 能够识别双链 DNA 的特定碱基序列并在特定位点断裂 DNA 双链。

这种精确的分子手术刀是大自然馈赠给生物化学工作者的礼物分析染色体结 旗开得胜 读万卷书 行万里路 4 构、测定非常长的 DNA 序列、分离基因、制造能被克隆的 DNA 分子都离不开限制性内切 酶在 1960 年代后期，Werner Alber 和 Hamilton Smith 发现了限制性内切酶，Daniel Natherns 首先应用限制性内切酶 不同原核生物都有限制性内切酶限制性内切酶的生物功能是断裂外源 DNA 分子，但 由于限制酶识别位点的碱基序列已被甲基化，因此限制酶不断裂生物自身的 DNA 分子很 多限制酶识别的核酸序列长度是 4 8 个碱基对， 这个区域两条核酸链都会被这个核酸内切 酶水解这些酶识别序列的显著特征是多数限制酶识别位点具有二重旋转对称换句话说， 使回文结构，或倒置重复限制性内切酶断裂位点也处于核酸链的对称位置例如，来源于 Streptomyces achromogenes的限制性内切酶识别的核苷酸序列是 这个酶水解对称轴两侧的 C-G 磷酸二酯键在第 9 章所介绍的内容指出，限制性核酸 内切酶酶切位点的对称性是由核酸内切酶自身结构决定的 现在已经鉴定并纯化的限制性内切酶有几百种。

对这些限制性内切酶的命名方案是前面 的三个斜写字母表示限制性内切酶的菌种来源（例如Eco表示限制酶来自Esterichia coli, Hin表示限制酶来自Haemophilus influenzae，Hae表示限制酶来自Haemophilus aegyptius） ，后面是菌株名（如有必要）和罗马数字（如果同一菌株分离出一种以上的限 制性内切酶） 图 5.1 列出了几个限制性内切酶的酶切位点 旗开得胜 读万卷书 行万里路 5 图 5.1 一些限制性内切酶的特异性这些酶识别序列有二重对称轴围绕该对称轴（绿色） 旋转 180 度，序列与原始序列相同红色箭头标出限制酶的酶切位置右边是限制酶的缩 写名称注意：有些限制酶平切，有些限制酶错开切（产生粘性末端） 限制性内切酶能够将 DNA 分子断裂成易于进行分析和操纵的特异片段例如长度为 5.1kb 的 SV40 是双链环状 DNA，能产生肿瘤这个 DNA 分子有一个EcoRI切点，4 个 HpaI切点，和 11 个HindIII切点一个限制性内切酶酶切 DNA 的产物可以用另一个限制 性内切酶酶切产生更小的 DNA 片段。

DNA 分子为限制性内切酶酶切产生的 DNA 片段图 谱可以作为该 DNA 分子的指纹实际上，用一些列限制型内切酶酶切产生的限制型内切酶 图谱可以对复杂染色体进行作图（这样的染色体可能含有数亿碱基对） 旗开得胜 读万卷书 行万里路 6 凝胶电泳分离、检测限制酶酶切的 DNA 片段 由于凝胶电泳能够分离、显示限制酶酶切的 DNA 片段，因此能够检测 DNA 分子间的 细小差异凝胶电泳的种类很多，大多数凝胶电泳的迁移率与 DNA 分子式量的对数值呈负 线性关系（在一定的分子式量范围内） 聚丙烯酰胺凝胶的范围达到 1000 碱基对，而琼脂 糖凝胶孔径更大，分子范围达到 20kb这些凝胶电泳的一个典型特征是分辨率高有些凝胶 电泳条件能够区分在几百个碱基对长的 DNA 分子间只相差一个核苷酸的 DNA 片段而且 长度达到数百万碱基对长度的整条染色体也能用琼脂糖凝胶电泳分离 此时采用的电场是在 不同方向施加脉冲电场（即脉冲电场凝胶电泳，PFGE)染色体在拉伸和松弛方面有差异， 因此短期内施加和切断电场能够在琼脂糖凝胶上分离染色体 放射性自显影能够显示凝胶上 同位素标记的 DNA 样品条带或点。

另外，用溴化乙锭染色也能显示凝胶上的 DNA 分子 当溴化乙锭插入 DNA 双螺旋，DNA 分子显示强烈的橘红色荧光（图 5.2） 一个条带只有 50 ng 的 DNA 量就足以用溴化乙锭显色观察 图 5.2 限制性核酸内切酶酶切 SV40 DNA 分子的凝胶电泳图谱 每孔相应于一种核酸内切 酶DNA 片段用溴化乙锭染色显示出荧光 限制片段长度多态性（RFLP） Southern blotting 能用来跟踪特定基因的遗传情况如果限制性酶切位点发生变异，限 制性内切酶酶切 DNA 片段的长度就会发生改变，导致 Southern blot 分析显示的 DNA 条带 旗开得胜 读万卷书 行万里路 7 用标记的核酸探针杂交凝胶分离的限制型内切酶酶切条带， 能够鉴定序列与探针互补的 DNA 片段（图 5.3） 限制性酶切产物用琼脂糖凝胶分离后，变性转化成单链 DNA，转移 到硝酸纤维素膜上DNA 片段在硝酸纤维素膜的位置与原来琼脂糖凝胶的位置相同然后 将 硝酸纤维素膜置于 32P-标记的 DNA 探针溶液杂交，探针能够结合与探针序列互补的 DNA 片段，放射性自显影能够显示这条 DNA 片段所在的位置。

这种方式能够从成千上万 种 DNA 片段中找出某一特定 DNA 片段（就像大海捞针） 这个技术是 Edwin Southern 设计的，因此成这种检测技术是 Southern blotting(印迹) 图 5.3 Southern Blotting. 先用电泳将 DNA 片段混合物分离，转移到硝酸纤维膜上，与 32P-标记的 DNA 探针（序列与目标 DNA 序列互补）杂交然后用放射性自显影观测目标 DNA 条带 旗开得胜 读万卷书 行万里路 8 也可以用类似的技术鉴定 RNA 分子RNA 分子也可以用凝胶电泳分离、转移到硝酸 纤维素膜上后也可以用杂交的方法鉴定这种方法叫 Northern blottingWestern blotting 是用特异抗体检测特定蛋白质的技术Southern, Northern, 和 Western blots 也称为 DNA, RNA，和 Protein blots. 选择性终止复制能测定 DNA 序列 DNA 序列测定技术也极大地促进了 DNA 结构和功能的研究 DNA 序列测定的关键是 产生一组 DNA 片段，其长度取决于 DNA 序列最后一个核苷酸。

Frederick Sanger 及其同 事建立了 Sanger 双脱氧方法（即选择性终止复制）测定 DNA 序列的技术与其他技术相 比，Sanger 双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应在这些混合物中，DNA 聚合酶 用来制造 DNA 单链模板的互补 DNA 序列合成引物是化学合成的 DNA 片段，与模板分 子的序列已知区互补除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有 少量的一种 2, 3-双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同 旗开得胜 读万卷书 行万里路 9 图 5.4 链终止法测定 DNA 序列的策略一种 23-双脱氧核苷三磷酸加入 DNA 聚合酶促 反应混合物产生一组 DNA 片段，其 3-末端就是这种 23-双脱氧核苷三磷酸例如 ddATP(红色）产生的 DNA 片段，其末端都是 ddA由于缺乏 3-OH，这种链不能继续延 伸 由于核苷类似物 3-末端缺乏 OH，这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长双 脱氧类似物浓度要足够低， 使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致 DNA 合成终止 DNA 聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。

例如，反应混合物含 有 ddATP 产生的合成 DNA 链长度不同，但是 3-端都是 ddA(图 5.4） ddA 参与的位点就 是待测核酸链的 T因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链 T 的位置一套（四种终 止混合物）双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读 出待测核酸序列 旗开得胜 读万卷书 行万里路 10 荧光检测的灵敏度很高， 能够替代放射性同位素 每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签， 这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光。