高级生物化学-蛋白质性质和分离.ppt

第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化 一、蛋白质的变性与复性蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失1.蛋白质变性的概念2.变性的本质次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体变性不涉及一级结构的破坏DenaturationP2333.变性理论 1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质4.变性的因素 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）变性理论和变性的因素 常用的变性剂：尿素尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用尿素或者胍尿素或者胍 变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）5、变性蛋白质的特性生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变性失去催化作用物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高粘度升高，密度降低密度降低，失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。

分子量不变）化学性质改变，如结构的伸展松散而暴露，易与化学试剂反应，易为蛋白质水解酶所分解制备活性蛋白质时严防蛋白质变性1.酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释原因？-2012年山东大学生物化学2.二硫键多蛋白质难变性3.胶原蛋白有特殊共价键4.纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？5、一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低一般的酶都是低温保存，但低温不稳定性酶在低温时变性，推测其机理温时变性，推测其机理2012年中山大学生物化学年中山大学生物化学6.酶敏感性的概念？思考题 思考题临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件误服重金属解毒方式?长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物？一种发生在蛋白质内部的Ala-Val突变导致蛋白质丧失活性，然而，如果这种蛋白质在第二位置发生Ile-Gly的突变，可使蛋白质恢复活性，试提出一种合理的解释江南大学2009年生物化学 思考题 蛋白质变性后的现象 -2011四川大学生物化学 核酸的变性(一)、DNA的变性(denaturation)1 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。

2 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等3 变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降粘度下降 比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失DNA的变性是爆发式的P508增色效应增色效应 增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在2030%之间假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后A260nm上升30%以上DNA和蛋白质变性的比较 DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降，降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降，其过程不可逆其过程不可逆DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键完好，一般是可逆的完好，一般是可逆的比较DNA和蛋白质变性的异同-2012中南大学生物化学 4、DNA的熔解温度（Tm）TmDNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

DNA的熔解温度（Tm）：（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应 的温度变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降DNA的Tm一般在8295之间（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素:DNA均一性：G-C含量：G-C含量与Tm值成正比介质中离子强度：1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)这种变性也称为可逆变性2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 3、举例：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质7、蛋白质的复性牛胰核糖核酸酶变性和复性1 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程 称为退火(annealing)2 DNA复性后的理化性质变化减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低 DNA的复性粘度上升 浮力 密度降低 生物活性部分恢复热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。

序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度有利于复性 DNA浓度复性 复性速度与DNA的浓度成正比 环状DNA易复性 一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢 影响复性的因素复性速度可用Cot衡量Cot1/2值：（1）概念：当C/CO/2时的Cot值定义为Cot1/2值，Cot1/2/K，即复性一半时的Cot值.（2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA 的Cot1/2值是不同的 与k值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响K值DNA分子序列的复杂性（X值）：(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值 如（ATATAT）,其X值为2,（ATGC）（ATGC）n 的X值为4 (2)X值与Cot1/2值的关系，X=KCot1/2 Cot1/2是与基因组的大小成正比的Cot1/2 表明基因组所包含不同序列的总长度 复性的Cot1/2 与其复杂度成正比任何DNA 的复杂度可以通过与复杂度已知的DNA Cot1/2 比较得出通常以大肠杆菌DNA 作为标准假设4.2106 bp 大肠杆菌基因组由不同序列组成（1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的相互靠近，从而促进DNA的复性。

2）温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性3）DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性试述下列因素如何影响DNA的复性过程1)阳离子的存在(2)低于Tm的温度(3)高浓度的DNA链思 考 在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢 可以通过哪些法来检测？(1)减色效应(hpochromic effcef)测定光密度,即OD值(optical density),DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2)羟基磷灰石柱层析 羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链 思思 考考判断：蛋白质构象变化是分子内的共价键断裂导致的厦门大学2009年生物化学考研试题厦1.蛋白质变性后，其性质有哪些变化？并解释 四川大学2011、厦门大学2005生物化学2.2.蛋白质变性主要由于氢键的破坏这一概念是由Anfinsen提出来的（是非题-）复旦大学2000年3.3.蛋白质变性的实质是非共价键断裂，天然构象解体，但共价键未发生断裂是非题-）中国科学院06年4.4.1 所有变性蛋白质都可以复性是非题-）5.4.2 核酸变性后对紫外光的吸收能力增强是非题+）6.4.3 核酸热变性有何特点？Tm值和Cot值分别表示什么？各有何应用价值？华东师范大学2006年思考题 江苏大学2004年硕士研究生入学考试生物化学试卷5.1 核酸变性或降解时，出现减色效应。

是非题-）5.2 结晶蛋白质都是变性蛋白质是非题-）5.3 盐析法可使蛋白质沉淀，但不引起变性，所以常用于 蛋白质的分离和纯化是非题+）5.4 蛋白质的变性是蛋白质分子立体结构的破坏，因此常涉 及肽键的断裂是非题-）5.5 变性DNA的复性与、等有关思考题思考题6下列关于蛋白质变性的叙述，哪项是错误的（）?A生物活性降低或丧失 B蛋白质空间构象破坏C280nm光吸收反应增强 D溶解度增加 E易被蛋白酶水解 江苏大学医学院2005年医学生物化学（硕士）7.双链DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（判断？）复旦大学2000年8.DNA的Tm值（）A.只与DNA链的长短有直接关系 B.与GC碱基对的含量成正比 C.与AT碱基对的含量成正比 D.与碱基组成无关 E.所有真核生物Tm都一样 湛江海洋大学2003年 思考题思考题8中山大学生物化学试题中山大学生物化学试题 8.1 变性温度与变性温度与DNA分子中的分子中的GC含量成含量成()()关系关系 8.2 尿素是蛋白质的变性剂，高浓度尿素可拆开蛋白质分子尿素是蛋白质的变性剂，高浓度尿素可拆开蛋白质分子中的二硫键中的二硫键判断正误题判断正误题)8.3 简述导致蛋白质变性的原因。

在实验操作中，可采取哪些简述导致蛋白质变性的原因在实验操作中，可采取哪些手段减少蛋白质分离纯化过程中的变性机会？手段减少蛋白质分离纯化过程中的变性机会？8.4 酶的抑制剂通过使酶蛋白变性而引起酶活力的降低或失活酶的抑制剂通过使酶蛋白变性而引起酶活力的降低或失活(判断正误题判断正误题)9.一段一段DNA的的Tm为为83摄氏度，求摄氏度，求ATCG百分比？百分比？-厦大厦大2012生化生化 思考题9.DNA变性时，随着结构和性质的变化，下述变化除何种变性时，随着结构和性质的变化，下述变化除何种外均会发生外均会发生)A.发生螺旋线团转换发生螺旋线团转换 B.沉降系数增沉降系数增加加C.减色效应减色效应 D.黏度下降黏度下降10.碱基堆积力在稳定核酸结构中非常重要碱基堆积力在稳定核酸结构中非常重要1）碱基堆积力碱基堆积力的化学本质究竟是什么的化学本质究竟是什么2）在核酸结构中，经常看到结合在核酸结构中，经常看到结合的金属元素，他们所起的作用是什么的金属元素，他们所起的作用是什么3）氢键也参与稳定氢键也参与稳定核酸的结构，但在哪一方面不同于碱基堆积力和金属离子与核核酸的结构，但在哪一方面不同于碱基堆积力和金属离子与核酸的作用酸的作用 -江南大学江南大学2009年生物化学年生物化学 11.简述导致蛋白质变性的主要因素，如何在蛋白质分离纯化简述导致蛋白质变性的主要因素，如何在蛋白质分离纯化中减少其变性的机会。

中减少其变性的机会江南大学江南大学2010年生物化学年生物化学思考题12.有两份有两份DNA样品，一份含腺嘌呤样品，一份含腺嘌呤32%，另外一份含，另外一份含17%，求两份样品的鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶的相对比例，并分析求两份样品的鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶的相对比例，并分析当中那个可能取自于嗜热菌，依据是什么？当中那个可能取自于嗜热菌，依据是什么？-2012暨南大学生物化学暨南大学生物化学13.何为核酸变性，何为增色效应，产生增色效应的原因是什何为核酸变性，何为增色效应，产生增色效应的原因是什么？么？-2012年山东师范大学生物化学年山东师范大学生物化学14.从生物样品中提取天然蛋白时，为什么一般要求用缓冲液从生物样品中提取天然蛋白时，为什么一般要求用缓冲液而且有一定离子强度？为什么强调在低温下操作而不是常温而且有一定离子强度？为什么强调在低温下操作而不是常温中国农业大学中国农业大学2010年生年生物化学物化学思考题（一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的。