细胞培养研究生实习课幻灯片-韩汶延

1、细胞培养 技术,临床医学研究中心 韩汶延,细胞培养技术 在现代医学和生物科学研究中应用广泛,第一节 基本知识 第二节 细胞生存环境、条件和代谢 第三节 基本技术（见视频）,第一节 细胞培养的基本知识,一、细胞培养的基本概念 二、培养细胞的类型及其特点 三、培养细胞的增殖过程,细胞培养cell culture （组织培养 tissue culture）概念,从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 凹窝玻璃悬滴培养法,细胞培养的目的与用途,科学研究：药物研究开发与基础研究 1、新药筛选； 2、疫苗研究与开发； 3、基因工程药物研究与开发； 4、细胞工程药物研究与开发； 5、单克隆抗体制备； 6、药物作用机理； 7、基因功能研究； 8、疾病发生机制研究,对细胞（组织）培养的评价,优点 1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。 2、便于用各种不同技术方法研究细胞。 3、培养细胞携带有体内细胞同等的基因组。 4、同时提供大量的生物

2、学性状相似的实验对象。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。 因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。,体内、外细胞的差异,体内细胞： 机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊）,体外细胞： 失去机体神经体液调节和 其他类型细胞影响 细胞的许多外来信号被切断 特定分化基因表达减弱或停止 而进化中保守的增殖活动维持 （由特殊到一般） 与体内细胞结构和功能的差异 特征：失去原有形态，分化特性减弱 形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代,高度特化的结构和功能,培养细胞的类型及其特点,培养细胞的形态分类 根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴附型和悬浮型。 1、贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞（Anchorrage-dependent cells）。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。 成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型,成纤维细胞,人肾小

3、管上皮细胞,多形型黄色瘤细胞,游走型巨噬细胞,2、悬浮型细胞（suspended cell type） 悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。,培养细胞的增殖过程,细胞增殖 细胞分裂形成子代细胞的过程。 增殖周期： 间期（ G1-S-G2 期）和有丝分裂期（M期） 群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期 间期持续时间较长，分裂期较短。,培养细胞的生命期,定义: 细胞在培养中持续增殖和生长的时间。一般可分为原代培养期、传代期和衰退期. 原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持14周。 细胞系：原代细胞一经传代就成为细胞系（Cell line），进入传代期。此期在全生命期中持续时间最长，一般传1050代。随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期。(Hayflick 极限的概念) 衰退期：细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞死亡。 肿瘤细胞：无限细胞系，永久增殖。,Hayflick极限,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代

4、次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,培养细胞一代的增殖过程,传代： 培养容器中细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液的过程 一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间 细胞一代的三个阶段： 潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行,第二节 细胞生存环境、条件和代谢,-培养的细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。,（一）环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。,(二)温度： 人哺乳动物：36.50.5; 鸟类：38.5; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强，温度上升不超过39时,细胞代谢强度与温度成正比。 3940 1小时,受损伤的细胞可能恢复； 4142 1小时,严重损伤,个别细胞恢复； 43以上1小时，细胞全部死亡。,温度不低于0时,细胞代谢有影响,无伤害作用; 置于 2535，细胞能生存，但生长速度减慢； 放在 4 数小时,再放回 37 细胞仍继续生长。 细胞代谢随温度

5、降低而缓慢，温度降至冰点以下时, 细胞因胞质结冰受损而死亡。,(三)气体环境 气体：氧气和二氧化碳 氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。 氧气分压199589975Pa,适用于封闭式单层细胞培养; 开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95空气加5二氧化碳混合气体环境中。,（四）细胞生存所需基本物质 与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。,细胞耐酸比耐碱性大一些,在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒，而在偏酸性环境中更有利于细胞生长。为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸盐缓冲剂方法，如PBS、Hanks平衡液等。,1、糖 是合成某些氨基酸的原料； 经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪； 经过糖解磷酸通路能合成核酸。 各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力, 其中葡萄糖最强,半乳糖最低。,2. 氨基酸： 12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr

6、)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。,需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成。 脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。,3.促生长因子： 培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。 胰岛素(1-10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸； 氢化可的松(10-8-10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率； 雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。 血清 是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分，用生物工程的方法提取并商品化。,4. 其它物质： 在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰等。 需要促细胞粘附物质其，作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上生长。,5.人工培养基： 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供

7、给细胞营养和保证细胞生长的物质。 培养基的种类分为半固体和液体培养基两类。 液体培养基：分为合成、天然和无血清培养基三种。,A合成培养基： 成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。 合成培养基在应用上广泛。,B天然培养基： 用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。 加入5血清：维持细胞不死或缓慢生长； 加入1020血清：细胞增殖生长。,血清的主要作用,提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。 补充培养液中没有或量不足的营养成分。 含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。 有中和毒性物质保护细胞不受伤害。 提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。,血清存在的问题,存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。 成分不明确，影响对结果的分析。 不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。,C.无血清培养基： 培养基内加入

8、促细胞生长因子，当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。 具有促进细胞生长增殖的作用。,第三节 细胞培养的基本技术,一、细胞分离和原代培养 二、培养细胞的传代 三、细胞计数 四、观察 五、细胞的冻存、复苏和运输 六、污染的检测和对策,一、细胞分离,细胞悬液：离心收集 组织块 1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法,二、培养细胞的传代 (subculture),原代培养的首次传代（数量、纯度） 细胞传代方法 贴壁细胞的传代 悬浮细胞的传代 细胞系的维持,细胞消化步骤,摇动培养瓶终止消化,倒掉细胞上清液,加入新鲜培养基培养,离心并分离细胞,洗涤细胞,细胞系的维持, 细胞系档案要记录好。 维持传代的规律性。 多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间的交叉污染。传代时所用器械要编号或做好标记，严禁交叉使用。 每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的绝种；另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变。,培养细胞观察,培养液 细胞生长概况 细胞形态

9、变化 微生物污染 细胞活力检测 （0.4% taipanlan染）,细胞冻存的原理,在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化，如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水等，能引起细胞死亡。向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在130以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50后，细胞仍能生长，活力不受损害。,细胞复苏的方法,1、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在1min内融化。 2. 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液移至离心管中，补加10ml培养液，5001000rpm低速离心5min，去上清（ DMSO 在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量除去），用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培养，次日更换一次培养液。待细胞生长至一定密度后即可传代。 冻存要慢，复苏要快,细胞复苏步骤,从液氮中取出冻存管,迅速放入 37C 水浴,将细胞转入无菌离心管,24h后观察培养的细胞,洗涤细胞,加入新鲜培养基，培养细胞,细胞悬液,单细胞层细胞,细胞的运输,1. 选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。 2 . 妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地， 对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。 3. 到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所 需的液量，置37培养, 次日传代。,微生物污染的途径,空气 器材 操作 血清 组织样本,培养细胞污染的概念,微生物 化学物质 细胞,

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