免疫学检验-免疫电泳技术ppt课件下载课件
31页1、,第七章 免疫电泳技术,,(counter immunoelectrophoresis,CIEP),原理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术,其在pH8.4以上的缓冲液中,大部分蛋白质抗原成分带负电,在电场中向正极移动;而作为抗体的IgG因其分子量大,暴露的极性基因较少,解离也少,在电场中亦向正极缓慢移动,但电渗引向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动,带动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉淀线,这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。,对流免疫电泳,,,火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis,RIE)技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项检测技术。,火箭免疫电泳,,火箭电泳操作时应注意以下几点: .所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的,否则火箭形状不规则。 .注意电泳终点时间,如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。 .标本数量多时,电泳板应先置电泳槽上,搭桥并开启电源(电流要小)后再加样。否则易形成宽底峰形,使定量不准。,,.作IgG定量时,由于抗原和抗体的性质相同,火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象,可用甲
2、醛与IgG上的氨基结合(甲酸化),使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷,加快了电泳速度,抵消了电渗作用,而出现伸向阳极的火箭峰。,,免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP)技术,是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技术。检测原理是将待测样品置于琼脂糖凝胶上进行电泳,样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同,被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后,沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清。置室温或37使两者扩散,经1824小时后,各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多,则反应沉淀线越接近抗体槽,形成的沉淀弧线较粗,反之,则形成的沉淀线较细。,免疫电泳,,以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白所处的电泳位置,将沉淀弧的位置、形态与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较,可分析待测样品中所含成分的种类及性质、例如,多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后,可观察到异常的M蛋白沉淀弧,而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可明显细、短于对照沉淀弧(图74)。,,,免疫固定电泳(immunofixation electrophoresis,IFE)是
3、区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术(IFE),1969年Alper与Johson相继报道了IFE在铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子转变中的应用,免疫固定电泳,,第九章 荧光免疫技术 荧光免疫技术(fluoroimmnoassay)是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法,是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。,,(一)荧光色素 许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用做荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素。,荧光物质,,常用的荧光色素有: .异硫氰酸荧光素(fluoresceln isothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm,可呈现明亮的黄绿色荧光。有两种同分异构体,其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好,在冷暗干燥处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优点在于:人眼对黄绿色较为敏感,通常标本中的绿色荧光较少,有利于降低
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