毒性作用机理

1、免疫毒理,免疫毒理学是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。本学科主要是研究外源性化学物质及物理因素对人和实验动物的免疫系统产生不良影响及影响机理。 免疫应答是宿主的一个重要防护与调节机理。由于免疫系统受损，就能大大增加传染病的发生率因此会间接影响动物的生命。本来很多外源性化学物质都是一些小分子的物质，是半抗原，并不能引起免疫应答，但当器官损伤以后，它和损伤的组织成分相结合就可能产生抗原性，引起免疫病理性损伤。对免疫功能检测有助于对外源性化学物质所造成损害的临床表现及病理过程有进一步的了解。 免疫毒理学的研究还有助于我们了解毒物损害的生物学机理。免疫应答具有高度的选择性和特异性，并且由多种免疫细胞和细胞因子参与完成。现在已经可以利用体外培养各种免疫细胞的方法，在培养液里加入各种外源性化学物质，有助于了解这些外源性化学物质作用的部位，并提供有关外源性化学物质与生物效应之间作用性质方面的资料。,免疫毒理,外源性化学物质对免疫系统作用的特点 1反应灵敏 很多外源性化学物质对免疫系统的不良反应的剂量往往低于它们的毒性剂量。 2反应的复杂性 外源性化学物质对免疫系统影响的复杂性，主

2、要表现在免疫反应的双重性和作用的选择性。机体对某种化学物可出现免疫增强或免疫抑制两种效应，它取决于剂量大小、接触途径及检测时间。不同的外源性化学物质作用于免疫反应的不同环节。,免疫毒理,具有免疫毒性的外源性化学物质 (1)抗肿瘤药物。环磷酰胺、氮芥、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、放线菌素、多柔比星等； (2)重金属，有机金属铝、镉、镍、铬、甲基汞、二氯二N-辛基锡、氯化二丁基锡、亚砷酸钠、砷酸钠和三氧化二砷等； (3)农药，DDT、狄氏剂、西维因、虫螨威、甲基对硫磷、代森锰、氯丹等； (4)卤代烃，多氯联苯、多溴联苯、三氯乙烯、氯仿、五氯酚、邻苯基酚等； (5)其它，如苯并芘、甲基胆蒽、已烯雌酚、苯等。 引起自身免疫的外源性化学物质有：乙酰唑胺、抗惊厥药、氯噻唑、异烟肼、甲基多巴、普萘洛尔、利福平、水杨酸、氯乙烯等。 引起过敏反应的外源性化学物质有抗氧化剂、抗生素(新霉素、头孢菌素、青霉素等)、氯胺T、二异氰酸酯、二氯酚、乙二胺、甲醛、金属(Pt、Ni、Be、Hg)等。,免疫毒理,外源性化学物对免疫功能影响的表现 1使免疫功能受到抑制或产生免疫缺陷 很多化学物质可对免

3、疫功能包括体液免疫和细胞免疫功能产生抑制作用。例如铅能损伤体液免疫和细胞免疫。 不是所有的化学物质都引起免疫抑制。如许多金属对免疫功能产生抑制作用，但是硒可以增强免疫反应。 2改变宿主的防御机理，降低机体抵抗力 机体在接触外源性化学物质后，可以改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般来说，细胞介导免疫或体液免疫严重抑制可引起宿主对一些感染因子敏感性增加，抵抗力下降。,免疫毒理,3产生变态反应 机体受抗原刺激后，产生的异常的体液或细胞免疫反应导致生理功能紊乱或组织损伤，称为变态反应。 化学物质引起的过敏反应有以下几个特点： 反应表现不同于该物质的一般毒性反应，组织病变不同于该物质的中毒性变化，而是变态反应性炎症； 初次接触某种化学物质后，经过1-2wk再次接触同一物质，反应即可出现 不完全遵循毒理学的剂量-反应的规律，很小的剂量进入体内即可致敏，再接触小剂量即可出现症状。 依过敏反应出现的快慢，抗体是否存在，把变态反应分为以下4型： (1)第1型速发型或反应类型。I型变态反应是IgE介导的变态反应。产生支气管哮喘，皮肤可出现红肿、荨麻疹等，作用于胃肠道则出现呕吐、腹

4、痛、腹泻等症状。,免疫毒理,(2)第型细胞毒型或溶细胞型。 型变态反应是抗体(IgG或IgM)引起带抗原的组织细胞的损伤或功能障碍。 IgG或IgM抗体与机体细胞(靶细胞)表面的抗原结合，通过活化补体、巨噬细胞吞噬或K细胞的抗体依赖细胞毒作用引起细胞的破坏死亡。靶细胞有红细胞、粒细胞、血小板、肾小球血管基底膜、肝细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞以及一些内分泌细胞等. (3)第型免疫复合物型。 型变态反应是由于抗原抗体复合物(免疫复合物)在组织中沉积而引起的炎症反应，炎症反应涉及补体的活化和中性粒细胞的浸润，释放出许多水解酶，并造成组织损伤。这类变态反应较常见于感染、药物治疗等弓起的免疫复合物病。如青霉素、磺胺引起的“血清病”。 (4)第IV型迟发型或细胞免疫型。IV型变态反应是由免疫的TD或TK细胞与特异抗原的反应而引起组织损伤。表面具有特异性受体的致敏淋巴细胞再次与抗原相遇，引起细胞增殖，其中TD细胞可释放淋巴因子，吸引和激活非特异性的巨噬细胞。由于细胞的增殖和浸润，可诱发迟发型变态反应。,免疫毒理,对免疫功能影响的机理 化学物质 免疫系统直接作用 免疫系统间接作用 作用细胞 (1)营养障

5、碍 非特异免疫 特异免疫 (2)内分泌紊乱 巨噬细胞 B细胞 (3)组织损伤而成 抗 原 T细胞 为自身抗原 K细胞 NK细胞 免疫毒性作用 免疫亢进 免疫抑制 过敏性疾病 自身免疫 感染 癌症,免疫毒理,免疫毒理研究方法： 由于免疫系统的复杂性，参与免疫应答的器官不是单一的，参与免疫反应的细胞也是多种多样的，因此想要确定一个外源性化学物质对免疫功能的影响，决不是用一个实验就能说明的，需要进行一组实验。1979年美国国家环境科学院(NIEHS)提出了一个确定免疫功能变化的筛选方案。由于这个方案包括的内容很广，测试项目太多，因此他们又提出了一个最低的筛选方案。,免疫毒理,外源性化学物质免疫毒性评价的基本检测项目 项 目 检测内容 病理毒性 血液学指标一白细胞计数及分类 脏器重量一体重、脾、胸腺、肝、肾、脑 宿主抵抗力 对植入同系基因肿瘤细胞的易感性LD1020 迟发型皮肤过敏反应 给予胸腺依赖抗原后的放射测定 淋巴细胞功能 有丝分裂原(PHA、ConA、LPS)刺 激成淋巴细胞化的作用 体液免疫 免疫球蛋白定量(IgG、IgM、IgA) 对羊红细胞(SRBC)的抗体空斑反应,免疫毒理,免

6、疫毒理研究方法 脏器重量、细胞学、组织病理学和免疫化学检查 体液免疫功能 细胞免疫功能 淋巴细胞增值反应 巨噬细胞功能 宿主抵抗力,免疫毒理,1. 脏器重量、细胞学、组织病理学和免疫化学检查 试验动物接触外源性化学物质后，对免疫系统的毒性表现为淋巴器官重量或组织学的变化，淋巴组织和骨髓的细胞在质和量上的变化，外周血白细胞数目的改变，因此在任何免疫毒性的评价中检测胸腺、脾脏、淋巴结的重量是很重要的。对淋巴气管和骨髓学的检查也是很有力的手段。 淋巴器官的常规组织病理学检查在评价外源性化学物质的免疫毒性是十分有用的，因为脾脏和淋巴结的结构可以分为依赖胸腺区和不依赖胸腺区，通过组织病理学检查就能获得外源性化学物质对T、B淋巴细胞影响。,免疫毒理,体液免疫功能 评价化学物质对体液免疫功能的影响的方法： a. 抗体滴度测定（免疫扩散、补体结合、血清中和、血凝、被动血凝、放射免疫分析、酶免疫吸附分析等） b. 抗体形成细胞（PFC） c. B细胞受体（Fc及补体受体）,免疫毒理,琼脂单向扩散法测定血清免疫球蛋白的含量，是一种不很敏感的但却很常用的方法，在使用免疫板前只需用标准血清绘制出一条标准曲线，

7、根据标准曲线查出血清中的Ig的含量，该方法只适用于测定血清中IgG、IgA、IgM的含量。,免疫毒理,目前测定血清抗体的滴度有两种比较灵敏的方法： 1. 放射免疫分析（Radio Immunoassay,RIA） 2. 酶联免疫吸附测定法（ELISA） ELISA法可测定抗原、半抗原或抗体，该方法灵敏高、重复性好，适合于大规模的筛选。,免疫毒理,PFC（Plague Forming Cell）,又称溶血空斑试验或空斑形成细胞试验，是检测外源性化学物质引起的体液免疫功能的改变的灵敏的最常用的方法。 PFC检查方法的原理是在体外创造一种条件，将抗原免疫鼠脾制成脾细胞悬液，在半固体凝胶介质种与羊红细胞（SRBC）混合，在平皿或玻片上制成薄层，37C孵育1.52小时后加入补体，由于靠近分泌特异性抗体（淋巴细胞）的靶细胞周围的SRBC被抗体致敏，因而激活了补体，形成溶血空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞。,免疫毒理,细胞免疫功能 细胞免疫功能主要是由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。测定细胞免疫功能的方法主要有：整体法（迟发型变态反应、移植物抗宿主反应和皮肤移植排斥

8、反应等）和体外法（淋巴细胞增值、T细胞细胞毒性及淋巴因子的产生）。 该方法的原理：当致敏的T细胞再次接触相应的抗原后，就能引起局部的致敏淋巴小释放出多种淋巴因子，导致发生以单核细胞浸润为主的炎症，表现为皮肤的红肿硬结，这种反应一般在抗原注射后2448小时出现。,免疫毒理,对人测迟发型变态反应可采用皮试法，该方法种所用的抗原有特异型病原微生物性抗原，也称回忆抗原，如结核菌素（OT）等，还有非特异性抗原，如二硝基氯苯及PHA等。该方法是用硬结的纵横直径平均值判断结果。 对试验动物的迟发型变态反应，可以用各种放射免疫分析法定量测定，该方法比皮试法灵敏。常用的抗原有KLH、PPD、BSA、BGG、SRBC等，对小鼠一般用KLH，大鼠用PPD。 钥孔戚血蓝素(Keyholelimpet hemocyanin,KLH ） 载体牛球蛋白（BGG）,免疫毒理,淋巴细胞增殖反应 淋巴细胞增殖试验是一个比较简单、重复性好，用来测定T细胞和B细胞功能活性的方法。 1960年Nowell发现，植物血凝素（PHA）和淋巴细胞在一起体外培养，数日后可看到明显肥大型母细胞，出现分裂旺盛，就是淋巴细胞转化试验。,免疫

9、毒理,淋巴细胞增值试验 常用的培养液有199、RPMI-1640. 刺激淋巴转化因子有特异和非特异两种。 非特异的刺激物有植物提取物、细菌产物、抗体、各种化学物质等。 常用的有植物血凝素、刀豆蛋白（ConA），主要刺激T细胞； 美洲商路（PWM）、脂多糖（LPS）,主要刺激B细胞。,免疫毒理,淋巴细胞增殖试验 检测方法包括形态学方法和同位素方法。 形态学方法比较简单，不需要特殊仪器，可在光学显微镜下观察，因为判断母细胞是按照形态学标准，该方法客观性较差。 液体闪烁测定法能客观反映淋巴细胞转化情况，但需要有同位素标记的胸腺嘧啶核苷和测3H的液闪仪。,免疫毒理,巨噬细胞功能 巨噬细胞在免疫反应中起很重要的作用: a.有非特异吞噬功能 b.细胞免疫和体液免疫，巨噬细胞的功能 c.吞噬作用、胞内杀伤 d.抗原摄取和处理 e.产生干扰素及对感染细胞或恶变细胞的融解作用。 测定方法： 体内对颗粒状异物清楚率、体外对颗粒的吞噬作用、胞内杀灭细菌的能力、对肿瘤细胞生长抑制的能力及某些酶的测定来评价。,免疫毒理,巨噬细胞功能 测定方法： a.体内对颗粒状异物清楚率 b.体外对颗粒的吞噬作用 c.胞内杀灭细菌的能力 d.对肿瘤细胞生长抑制的能力 e.某些酶的测定来评价。,免疫毒理,宿主抵抗力 机体接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般来说，B细胞缺损的机体对细菌敏感性升高，T细胞缺损的机体对病毒。寄生虫、肿瘤敏感性升高。 检测宿主抵抗力是在整体动物身上进行的试验，可将体内外各项免疫功能测定结果之间以及它们与整体间相互联系作全面的解释。 检测试验主要有 a. 对病原体的抵抗试验 b. 肿瘤细胞攻击试验,免疫毒理,对病原体的抵抗试验 本试验是用啮齿类动物做感染动物，由他们对传染原抵抗力不同来判定化学物质的免疫毒性。 试验中选用传染原是需考虑的因素：

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