生物成分的分离与测定技术课件（苏教版选修1）

1、第四章 生物化学与分子生物学技术实践,第四章 生物化学与分子生物学技术实践,第一节 生物成分的分离与测定技术,学习导航 1.尝试蛋白质的提取和分离。(重点) 2理解蛋白质分离与纯化的原理。(重难点) 3研究从生物材料中提取某些特定成分。(重点) 4尝试测定生物材料中某些化学物质的含量。(难点),研磨法,稀碱性溶液,透析液,有机溶剂,2.纯化 (1)原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、_、吸附性质等方面存在差异。 (2)方法 透析法：利用蛋白质分子不能透过_ 的特性使蛋白质与_分离开来。,所带电荷的多少,半透膜,其他小分子化合物,离心沉降法：通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。 电泳法 a含义：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象； b原理：不同物质在同一电场中的_不同；,泳动速度,c泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球 形，所带净电荷_，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。,越多,1(1)常用吸水涨破的方法释放哺乳动物成熟的红细胞中的蛋白质。() (2)通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质。() (3)电泳是带

2、电颗粒在电场作用下向着与其电性相同的电极移动的现象。(),判一判,二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作 1.原理 血清蛋白包含一组蛋白质，其大小、形状、所带净电荷各不相同，在电场作用下会发生_。 2.操作流程 配制试剂_浸泡薄膜细心点样_实施电泳_漂洗脱色。,电泳,架滤纸桥,平悬薄膜,染色,3.实验结果分析 呈现5条蛋白质色素带，从点样处一侧开始，依次是：-球蛋白、_蛋白、2-球蛋白、1-球蛋白和_。,-球,清蛋白,人们常说的血清蛋白是一种蛋白质吗？说说你了解的情况。 提示：不是一种蛋白质，而是包含多种蛋白质：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白。,想一想,三、从生物材料中提取某些特定成分 芳香油特点：具有_，能与水蒸气一起蒸发，易溶于_，如石油醚、乙醚或_等。 橘皮芳香油的特点：橘皮芳香油存在于 _中，具有一定的_，其沸点_水的沸点。 植物芳香油提取方法：蒸馏、_等。,挥发性,有机溶剂,酒精,果皮的油细胞,挥发性,低于,萃取,2(1)水蒸气蒸馏法的基本原理是植物芳香油易溶于水。() (2)蒸馏装置中进水口在上方，出水口在下方。() (3)橘皮油可以通过机械加压、压榨出果皮

3、中的芳香油进行提取。(),判一判,1.电泳法：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。支持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。,支持物可以是滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品的分析(血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定)等方面。,几点说明： (1)膜的预处理：必须于电泳前将薄膜浸泡于缓冲液中，浸透后，取出薄膜并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。 (2)加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白的常规电泳分析，每厘米加样线不超过23 L，相当于6080 g的蛋白质。,(3)电泳：可在室温下进行。电压为25 V/cm，电流为0.40.8 mA/cm。 (4)染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春 红，血浆蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸Schiff试 剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 (5)脱色与透明：对水溶性染料应用最普遍的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收

4、扫描测定，可浸入冰醋酸无水乙醇37的透明液中。,特别提醒 第一步中缓冲液要用容量瓶准确配制，试剂要多配一些备用。第二步中要驱除气泡，贴紧贴 实，避免影响电泳速度和分离效果。第三、四步中作有记号的醋酸纤维薄膜光泽面朝下。第七步中染色时间要适中(510 min)，不宜过长或过短。第八步中漂洗要彻底，防止遮盖蛋白质色带颜色。,2.响电泳泳动速度的因素 影响电泳泳动速度的因素很多，其中主要因素有带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少；此外，还有电场强度、溶液的pH等因素。 3.注意事项 (1)保持醋酸纤维薄膜的清洁，避免用手直接接触薄膜。,(2)点样要适量，2次左右即可，盖玻片的边缘应避免出现明显液滴，点样要尽量在一条直线上。 (3)电泳时间不低于1 h。 (4)点样处不要搭在滤纸上，以免血清渗入滤 纸。 (5)醋酸纤维薄膜应绷直，避免电泳槽隔离板的干扰。 (6)不可同时接触正负极，防止触电。,4.容易产生的几种现象 (1)电泳图谱不齐：点样时血清滴加不匀。 (2)电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水分蒸发干燥造成的。 (3)分离

5、不良：样品滴加过多。 (4)区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05。 (5)区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075。,(6)染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋白含量过高，此时可减少检样用量或延长染色时 间。 (7)球蛋白向反方向移动：系电渗现象，可升高点样端缓冲液液面高度，或适当加大电流量克服之。 (8)透明时若膜不干或透明液中醋酸含量不足，可造成膜发白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量过 高，或室温过高，可使膜溶解，此时可酌情减少醋酸含量。,(2012南京高二检测)仔细观察下图，所带负电荷少的球蛋白是( ),A1-球蛋白 B2-球蛋白 C-球蛋白 D-球蛋白 【解析】 对于几种球蛋白来说直径相差不 大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且-球蛋白距点样处最近，所以-球蛋白所带负电荷最少。 【答案】 D,【探规寻律】 必须清楚泳动速度的差异主要取决于电荷的多少。所带净电荷越多，则在电场中泳动的速度越快，反之则越慢。,1.有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别为4.5、5.2、6.6、7.2，电泳时欲使其中三种泳向正极，缓冲液

6、的pH应该是( ) A2.0 B5.0 C6.0 D7.0 解析：选D。在缓冲液的pH为7.0的溶液中，pH分别为4.5、5.2、6.6的蛋白质均带负电荷，在电泳时移向正极。,变式训练,特别提醒 在用萃取法提取芳香油时，由于要将有机溶剂从萃取液中蒸发出去，故萃取剂的沸点要比所要提取芳香油的沸点低。,在蒸馏过程中，要提高产品质量，应该采取的措施是( ) A提高蒸馏温度，延长蒸馏时间 B提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间 C降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间 D严控蒸馏温度，延长蒸馏时间,【思路点拨】 解答本题可以从两个角度分析： 温度过高会破坏蒸馏提取物的有效成分。 时间过短会使有效成分得不到有效提取。,【解析】 用蒸馏法分离植物有效成分时，温度会影响其性质，如果温度过高则破坏其结构，温度过低则分离不出其有效成分。如果在一定温度范围内延长蒸馏时间，就可以得到较多的植物有效成分。 【答案】 D,互动探究 在水蒸气蒸馏装置中，为什么要让冷水由冷凝管的下方流入，上方流出？ 【提示】 这样可以冷却得更充分。,1.蒸馏法：植物芳香油提取的常用方法,(1)水蒸气蒸馏装置的安装顺序和方法,如上图所示，整套蒸馏装置可分

7、为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸 馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接 收。安装仪器一般都按照自下而上、自左到右的顺序，拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下： 固定热源酒精灯。,固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如上图中所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。 安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。 连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。 连接接液管(或称尾接管)。,将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接收瓶，接收瓶应在实验前称重，并作好记录。 将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。,2.萃取法 (1)原理：植物芳香油可以溶于有机溶剂(石油醚、酒精、乙醚、戊烷等)中，对于不适于蒸馏的原料可以采用萃取法。大致方法是将干燥的植物粉碎，用有机溶剂浸泡后，芳香油就会溶解在溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂就可以获得植物芳香油了。,玫瑰精油提取的过程是( ) A鲜玫瑰花水水蒸气蒸馏油水混合物分离油层除水 B鲜玫瑰花水油水混合物水蒸气蒸馏分离油层除

8、水 C鲜玫瑰花水油水混合物除水分离油层 D鲜玫瑰花水油水混合物水蒸气蒸馏分离油层除水,【解析】 玫瑰精油提取的一般流程是将鲜玫瑰花和清水先按14的质量比混合，然后利用水蒸气蒸馏法获得油水混合物，再加入NaCl，分离油层，进而加入无水Na2SO4，将油层中的水进一步除去，最后过滤获得玫瑰精油。 【答案】 A,变式训练 2.用蒸馏法提取玫瑰精油的有关叙述错误的是( ) A蒸馏温度高，水和玫瑰精油挥发得就容 易，所以在高温下蒸馏效果好一些 B为了充分蒸馏玫瑰精油，应该在较低温度下延长蒸馏时间 C在乳浊液分层的时候，为了利于水和油层的分开，向乳化液中加入氯化钠,D水和油层分开后，应在初提取的玫瑰精油中加入适量的无水硫酸钠吸去残留的水分，放置过夜，经过滤除去固体硫酸钠后，就可以得到玫瑰精油 解析：选A。蒸馏温度太高、时间太短，玫瑰精油的品质就比较差，如果要提高品质，就需要在较低温度下延长蒸馏时间。,向乳浊液中加入氯化钠，增加盐的浓度，有利于水和油分层，通过分液漏斗排去水，得到粗提取的玫瑰精油，再加入适量的无水硫酸钠吸去残留的水分，放置过夜，过滤除去固体硫酸钠后，就可以得到玫瑰精油。,【操作与实践】,血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,【结果及分析】 1.区带不分离，没有出现理论上的5条带。 原因：电泳时间不够，电压偏低，点样量过多。 2.区带不清晰，颜色很浅。 原因：点样量不够。 3.区带不平行，弯曲、间断。 原因：点样时未点在一条直线上，醋酸纤维薄膜上的醋酸纤维素粉涂布不均匀。,【问题与探究】 1.漂洗液与透明液的区别是什么？ 【提示】 从功能上看，漂洗液用来洗脱背景颜色，而透明液用来脱水固定(使显色后的区带长久保存)；从成分上看，透明液中乙醇含量70%(V/V)，远高于漂洗液，脱水效果明显。,2.为什么要盖上盖子进行电泳？ 【提示】 为了使电泳槽内维持饱和蒸汽压，以免醋酸纤维薄膜在电泳过程中因电流通过发热而变干。,【例题】 某蛋白质等电点为7.5，在pH为6.0的缓冲液中进行自由界面电泳，其泳动方向为( ) A向负极移动 B向正极移动 C不运动 D同时向正极和负极移动,【解析】 在pH6.0的缓冲液中蛋白质带正电荷，其泳动方向为向负极移动。 【答案】 A,本部分内容讲解结束,按ESC键退出全屏播放,

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