微生物遗传变异与菌种保藏（增加内容）课件

1、第八章 微生物遗传变异 与菌种保藏(增加内容),本章内容： 第一节 遗传的物质基础 第二节 基因突变及修复 第三节 基因重组 第四节 微生物诱变育种 第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,第一节 基因突变与诱变育种,一、基因突变 二、突变与育种 三、营养缺陷型的筛选,一 基因突变,（一）突变类型 （二）突变的特点 （三）基因突变自发性及不对应性证明 （四）基因突变的机制 （五）DNA的损伤及修复,（一）突变类型,细胞形态 1、形态突变型 菌落形态 营养缺陷型 2、生化突变型 抗性突变型 抗原性突变 （包括细胞内部、表面成分的改变）,3、致死性突变型 （合成关键性酶的基因发生了突变，则表 现出致死突变） 条件致死突变型 如突变为温度敏感型突变（37死， 25活） 4、其它突变型 毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。,（二） 突变的特点,1 非对应性：环境与变异无对应性。 2 自发性：非人为的诱变因素下发生。 3 规律性：某一特定性的突变率具规律性。 4 独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。 5 稀有性：生物自发突变率为10-610-12。 6 诱变性：诱变剂可提高突变率10105X

2、。 7 稳定性：突变性状稳定、可遗传。 8 可逆性：有回复突变。,（三）基因突变自发性及不对应性的证明 （自学）,自发突变：没有人工诱变因素的参与， 生物体自然突变。 1、彷徨试验： 2、涂布试验： 3、平板影印(Replica plating)培养试验：,彷徨试验,（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前 （2）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用； （3）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。,平板影印培养试验,（1）突变与噬菌体无关； （2）涂布使抗性菌株均匀分布； （3）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。 以上实验用统计学原理间接证明。,影印培养试验,（1）实验表明：从未接触 str 的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的 str 菌株。 （2）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。,（四）基因突变的机制（自学）,1 DNA的复制（核苷酸对掺入错误） 微生物自身产生诱变物质 （咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等） 环境对微生物的诱变作用 （辐射、加热等）,（五） DNA损伤及修复（自学）,1 光复活作用 2 切除修复 3 重组修复 4 SOS修复,二 突变与育种,（一）

3、自发突变与生产育种 （二）诱变育种,（一）自发突变与生产育种,1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现 出生长优势，发现突变种后，随 时分离、纯化。 2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生 物群体,同时不断对其移种、传代， 以达到积累和选择合适的自发突变 体的一种育种方法。,（1）自发突变(spontaneous)： 在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化 引起的性状变异。 （2）原因可能是： 1）环境因素； 2）自身有毒产物的积累； 3）互变异构效应；,3、自发突变的机制,二 诱变育种,1、概念 2、诱变剂 3. 诱变程序 4、诱变的主要环节,1、概念 诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,（1） 概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。 （2） 种类： 1）物理因子（phisical agents) 物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。 2）化学因子(chemical agents) 3）转座子(transposable elements),2、诱变剂,烷化剂 (alky

4、lating agents)： 如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、 NTG等 机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。,化学诱变剂：,碱基类似物 (base analogs)： 如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等； 机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱基 类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复制时 出现突变体。,插入剂 (intercalating agents): 如：溴化乙啶等一些三环分子。 机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些 分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋 中，加宽间距，引起碱基增加。t,3. 诱变程序：,原始菌种 原菌种特性鉴定 纯化 斜面/肉汤 培养单孢子/单细胞悬液 诱变剂处理 计算存活率 平板分离 观察形态变异，挑单菌落 移至斜面 初筛 复筛 小试 良种保藏 中试,4 诱变的主要环节,（1）诱变剂的选择 （2）出发菌株的选择 （3）单孢子或单细胞悬液的制备 （4）设计和采用效率高的筛选方案和方法,（1）诱变剂的选择： 1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。 2）处理方式 A、单一因子处理：先后使用 B、复合因子处理：两种以上因素同时使

5、用单一 因子重复使用。 3）处理剂量：测致死率。 方法：平板菌落计数法、 纸片法 一般杀菌率为70%左右。,（2）出发菌株： 育种的原始菌种应具备： 1）对诱变剂的敏感性高； 2）生产中选育过的自发变异菌株； 3）本身具有一些有利性状； 4）对代谢产物有一定积累； 5）已经发生过某些变异。,（3）单孢子或单细胞悬液的制备 1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不 纯的菌落菌种退化。 2）制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液。 3）方法： 三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂），用无菌脱脂 棉过滤。 4）浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法 1）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的 生理效应范围。 方法 梯度平板法（抗性菌株） 纸片法（抗性菌株） 透明圈法（淀粉酶产生菌株等） 变色圈法（氨基酸生产菌株） 2）复筛：（见P250） 较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定,三、营养缺陷型的筛选,（一）概念 （二）筛选方法,（一）概念,1.

6、 三种遗传型个体 2、筛选用的培养基,1. 三种遗传型个体,（1）营养缺陷型（auxotroph）： 经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。 如：lys - ; bio - ; （2）野生型(wild type)： 自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突 变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys+;bio+; （3）原养型 (prototroph) ： 指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,2、筛选用的培养基,1）基本培养基（minimal medium,MM）-： 满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。 2）完全培养基（complete medium,CM）+： 满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。 3）补充培养基（supplemented medium,SM） x： 在MM中有针对性地加入一或几种营养成分 以满足相应 auxo生长的组合培养基。,（二）筛选方法,1、诱变处理 2、 auxo的浓缩 3、auxo的检出 4、auxo的鉴定 5、auxo的应用,1. 诱变处理（同前),a

7、uxo的筛选程序： 细菌培养 离心洗涤 诱变处理 CM后培养 洗涤 MM加PN 涂布于CM平板 影印培养 挑取 鉴定 菌种保存。,2. auxo的浓缩：,（1）抗生素法： 1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的 微生物细胞，对休止态细胞无作用。 2）方法：菌培养在含抗生素的MM基中。 （2）菌丝过滤法： 1）适用于丝状（放线菌、霉菌） 2）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可 通过滤膜，野生型菌丝不能通过。 （3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀 死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。,3. auxo的检出,（1）逐个检出法 （2）影印平板培养法 （3）限量补充法 （在mm中加0.01%蛋白胨， auxo菌落小，野生型大） （4）夹层培养法,4. auxo的鉴定,（1）生长谱法 1）方法简便； 2）回变和污染不影响结果 3）测定物质可为粉末或纸片 （2）混合氨基酸（Vit）法 混合氨基酸法步骤： 1）将多种营养因子编组，如： 2）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养 3）结果分析 4）营养因子分组编排时注意：

8、 A、每组内无重复的营养因子 B、每组中应包含只出现一次的因子 C、每组中其他因子应分别出现二次,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,5. auxo 的应用,（1）作为标记菌株： 进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记； （2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； （3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,第二节 基因重组,一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组,基因重组 把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。 基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平,如： 甲 乙 生长快、产量低 生长慢、产量高 基因重组 生长快、产量高,一、原核生物的基因重组,（一）转化（transformation) （二）转导(transduction) （三）接合(conjugation) （四）原生质体融合（protoplast fusion）,（一）转化（transformation),概念 受体细胞(receptor)直接

9、吸收了来自供体细胞(donor)的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,1. 感受态 2. 感受态因子 3. 转化因子 4. 转化的检出,（1）感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并 实现其转化的一种生理状态。 （2）转化的决定因素：不同菌株的亲缘关系;受 体细胞是否处于感受态；不同菌出现 感受态的时间不同。,1. 感受态,一种胞外蛋白质，分子量为510kD其作用为： （1）催化转化，促进外来DNA片段吸收。 （2）可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露。 1）不同菌细胞DNA受体位点不同。 2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用。,2. 感受态因子,3. 转化因子,（1）转化因子由供体提供 （2）一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链 有转化能力，单链没有。 （3）自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里 通过提取获得。 （4）转化的频率往往很低，一般为0.11%。据研究， 呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转 化频率最高。,游离的片断叫转化因子,4. 转化的检出,甲-受体strr，lys- 在含str的MM上培养 乙-供体strs，lys+ 如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化 。,

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