专2-1-微生物的实验室培养幻灯片

1、专题 2 微生物的培养和应用,微生物包括五类,病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物,一、微生物,一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。,细菌的形态,球菌,弧菌,杆菌,螺旋菌,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。,芽 孢,单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,放线菌,繁 殖,孢子丝 | 孢子,菌 落,.定义：,由单个或许多细菌（或其他微生物）细胞在适宜固体培养基中生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：,大小、形状、颜色等。,.功能：,作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,根霉 曲霉 青霉,几种菌落及其形态,课题1 微生物的实验室培养,（1）合适的营养和环境条件,（2）确保其他微生物无法混入,五大类营养要素物质：,二、微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.生长因子 4.无机盐 5.水,

2、凡是能为微生物提供所需C元素的营养物质。,无机碳源：CO2；NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的主要能源物质,.概念,.来源：,.作用：,1.微生物的碳源,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2.微生物的氮源,.概念：,.来源：,.作用：,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,.作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、碱基等。,例：可以作为硝化细菌碳源、氮源和能源的是（ ） A.CO2、NH3、光能 B.(CH2O)、N2、NH3 C.CO2、NH3、NH3 D.(CH2O)、NH3、N2,C,例：关于微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ） A、是碳源的物质不可能同时是氮源 B、凡碳源都提供能量 C、除水以外的无机物只提供无机盐 D、无机氮源也能提供能量,D,三、培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,（1）

3、按物理状态来分：分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。 （2）按成分来分，分为天然培养基和合成培养基。（3）按用途来分，分为选择培养基和鉴别培养基。,培养基的类型和用途：,培养基的成分：水、碳源、氮源、无机盐 (和生长因子。),不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,鉴别培养基 在培养基中加入伊红美蓝试剂，可以鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌， 如果有则出现深紫色菌落，并带有金属光泽,几种选择培养基,加入青霉素的培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌,不加氮源的无氮培养基,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物,加入高浓度食盐的培养基,分离金黄色葡萄球菌,【巩固1】 下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别

4、培养基的依次是 ( ),A. B. C. D.,D,1.何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？,2.什么是消毒？灭菌？两者有何区别？,3.常用的消毒与灭菌的方法有哪些？有何要求？,4.请说出干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法的操作步骤。,四、无菌技术,1.无菌技术的概念,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,是成功地培养微生物的关键。,（1）消毒定义：,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）,（2）灭菌的定义：,使用强烈的物理或化学方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,消毒与灭菌的比较,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。 巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。(不耐高温的液体：牛奶) 化学药剂消毒法：用75%酒精进行皮肤消毒；氯气消毒水源。 紫外线消毒,.消毒的方法：,常用的消毒与灭菌的方法,（2）灭菌的方法,a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、涂布器)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 1601

5、70 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,五、实验操作,实验目的：,用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养。,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基,（二）纯化大肠杆菌,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算 2.称量 3.溶化 4.灭菌 5.倒平板,操作步骤：,自主阅读P16-P17,五、实验操作,倒平板操作,1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。,思考1：培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,约50,刚好不烫手,倒平板操作,2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火

6、焰。,思考2：为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,倒平板操作,3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约1020mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。,倒平板操作,4.等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,思考3：平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,思考4：在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,1.接种：,方法：平板划线法，稀释涂布平板法,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,（1）平板划线法:,在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。,平板划

7、线的操作方法,平板划线的操作方法,1.将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。,2.在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开盛有大肠杆菌菌液的试管的棉塞。,平板划线的操作方法,3.将菌液试管口通过火焰。,4.将冷却的接种环伸入到菌液中,沾取一环菌液。,平板划线的操作方法,5.将菌液试管口再次通过火焰后塞上棉塞。,6.将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划35条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。,平板划线的操作方法,7.灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连,8.将平板倒置放在培养箱中培养。,讨论1：为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？,避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,讨论2.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次

8、划线的末端开始划线？,答：划线后，划线末端细菌的数目比划线起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（二）纯化大肠杆菌,（2）稀释涂布平板法,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。,在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,a.系列稀释操作：,菌液,（2）稀释涂布平板法,浸,a.系列稀释操作：,b.涂布平板操作：,滴,灼,涂,（2）稀释涂布平板法,1.将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。,2.取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。,3.将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却810s。,（二）纯化大肠杆菌,2.培养：,将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中，培养12h24h后，分别观察并记录结果。,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？ 未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？ 如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,六、结果分析与评价,4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。 无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,六、结果分析与评价,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？ 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,1.临时保藏：,接种到试管的固体斜面培养基上，培养长成菌落,4冰箱保存,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油（灭菌）1ml菌液,20冷冻箱保存,搁置斜面,七、课题延伸-菌种的保藏,

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