临床血液学检验技术第二节细胞化学染色检验

1、,第二节 细胞化学染色检验,为什么要做组织化学染色,火眼金睛能辨认出什么细胞？,原始淋巴细胞？,原始单核细胞？,原始粒细胞？,其它肿瘤细胞？,细胞化学(或组织化学)是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分、定位、定量及代谢功能状态的学科。,细胞化学染色 Cytochemical Staining,实质是原位显示细胞成分结构，为不移动有机化学物。 细胞化学染色包括三个步骤：,固定,有色沉淀反应,复染,细胞化学染色的基本步骤,固定（fixation） 物理法：干燥、火焰 化学法：液体固定(甲醛、乙醇、甲醇、丙酮),显示(display)：通过化学反应形成有色沉淀显示被测物质。 偶氮偶联法 联苯胺法 普鲁士蓝法 雪夫反应 金属沉淀法,保持细胞结构及化学成分的不变,使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。,细胞化学染色的基本步骤,复染(double staining) 复染颜色应与有色沉淀的颜色有明显对比。,化学定量（chemical quantitative analysis） 定性 半定量 定量,过氧化物酶染色 过碘酸-雪夫反应 酯酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶

2、染色 铁染色,1.实验方法,1958年 Washburn 复方联苯胺法 1965年 Kaplow 二盐酸联苯胺法 1985年血液学国际标准化委员会(ICSH) 二氨基联苯胺法（DAB染色法） 过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法 二盐酸联苯胺法,一、过氧化物酶染色,Peroxidase Staining (POX ),2.染色原理,二氨基联苯胺法 二盐酸联苯胺法,3.血细胞阳性程度的判断：,（-） 无颗粒沉着 （） 颗粒细小，分布稀疏 （+） 颗粒较粗常呈局灶性分布 （+） 颗粒粗大分布较密占胞浆1/22/3 （+） 颗粒粗大，呈团块状分布 （+）颗粒布满细胞，可覆盖胞核,4.参考范围 粒细胞系 原粒-/，粗粒聚集状；随细胞成熟反应渐强；衰老细胞因过氧化酶活性降低而反应减弱; 嗜酸粒细胞为强阳性反应; 嗜碱粒细胞呈阴性或弱阳性反应。 其它细胞 成熟单核细胞、组织细胞呈-或 ； 幼红细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞及血小板均为阴性反应。,5.MPO临床意义,POX主要存在于线粒体和溶酶体中，定位于中性粒细胞和单核细胞嗜天青颗粒中。 急性白血病MPO反应强弱顺序 M3M2bM2aM6(粒)M4

3、M1M5HALALL ALL和AML鉴别： ALL MPO阴性 判断急性白血病类型首选组化,ALL,L1 L2 L3,AML,M0急性髓细胞白血病微分化型 M1急性原始粒细胞白血病未分化型 M2 M2a,M2b急性原始粒细胞白血病部分分化型 M3 M3a,M3b急性早幼粒细胞白血病 M4 M4a,M4b,M4c,M4Eos急性粒-单核细胞白血病 M5 M5a,M5b急性单核细胞白血病 M6急性红白血病 M7急性巨核细胞白血病,急性白血病的FAB分型,急性髓细胞白血病MPO特点,粒系MPO：阳性反应物颗粒粗大，聚集。 单核系MPO：阳性反应物细颗粒状，弥散,早幼粒以下随细胞分化成熟而；,特点：阳性物在细胞核的凹陷处聚集成团，呈团块状反应。,M2b中异常中幼粒细胞MPO呈强阳性,特点：阳性物充满胞浆，细胞外浆一般为阴性。,M3呈强阳性反应。,M4MPO染色,M5MPO染色,急性淋巴细胞白血病MPO阴性,急淋ALL,急粒AML,急单AMOL,急粒APL,过氧化物酶染色 过碘酸-雪夫反应 酯酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 铁染色,periodic acid-schiff，PAS 又名糖原染色

4、,二、过碘酸-雪夫反应,1.原理： 氧化剂过碘酸把-CHOH-CHOH变成-CHO-CHO，此新生的双醛基使无色碱性品红失去亚硫酸发生结构重排，回复品红的对醌结构显红色，颜色深浅与细胞内乙二醇基的含量成正比。,2.阳性结果 阳性结果为胞质内出现粉红色物质。 细胞核为蓝色。 颗粒状 片状 珠状 块状,阳性率：100个计数细胞中阳性细胞的个数 阳性指数：100个细胞中阳性细胞，按不同强度的细胞个数乘以相对应强度之和。 例：（+）1 +（+）2 + （+）3 +（+）4,阳性率及阳性指数计算法,细颗粒弥散状,PAS为裙边样反应,细颗粒弥散状见小珠,中粗颗粒散在分布,PAS珠状、块状呈冠状。,3.正常血细胞染色反应 粒细胞系 原粒细胞多呈（），少部分见（-）。 随细胞的成熟阳性反应渐强； 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞浆呈弥漫粉红色； 嗜碱粒细胞为阳性，反应物呈粗颗粒、珠状和块状。,淋巴细胞系 大多数呈（-） 少数胞质内有少量红色颗粒 B淋巴细胞PAS正常值为阳性率20% 红细胞系 幼红细胞和成熟红细胞均呈（-） 。 巨核细胞系和血小板 （-）或（+） 阳性物呈珠状或块状,单核细胞呈（

5、+），阳性反应物为细颗粒弥散状、中粗颗粒往往位于胞浆边缘； 浆细胞大多呈（-），少数为红色颗粒； 组织细胞为（-）/（+）； 巨噬细胞可呈细颗粒（+）。,4.临床意义 白细胞系统疾病辅助鉴别 淋巴白血病细胞 阳性细、中粗和粗颗粒散在分布； 珠状和块状一个至数个成冠。,ALL PAS(-),中粗、粗颗粒散在分布,ALL PAS珠状,急粒细胞白血病原幼粒细胞 阴性或弱阳性 细颗粒弥散状,M2b PAS细颗粒弥散状,M3,急单白血病原幼单细胞 阳性较粒细胞强 细、中粗颗粒弥散状分布，边缘及外浆处可见粗颗粒。 部分在细颗粒基础上可见小珠； 少数呈裙边样反应。,巨核细胞白血病细胞:强阳性， 阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。,红细胞系统疾病,良性：IDA、地贫、巨贫、AA、HA -阴性或弱阳性； 非良性：红白血病、MDS、急性白血病的幼红细胞阳性。,IDA PAS,MDS PAS染色,M6 PAS 染色,过氧化物酶染色 过碘酸-雪夫反应 酯酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 铁染色,(Esterase), 酯酶分类 特异性酯酶:氯乙酸萘酚AS-D酯酶 (Naphthol AS-D chloroace

6、tate esterase，NAS-DCE) 非特异性酯酶 -醋酸萘酯酶 (Alpha-naphthol acltate esterase,-NAE) 醋酸AS-D萘酚酯酶 (Naphthol AS-D acltate asterase,NAS-DAE) -丁酸萘酯酶 (Alpha-Naphthol butynate asterase, -NBE),三、酯酶染色,国际血细胞标准化委员会1985年 固紫酱GBC法 新品红方法,特异性酯酶染色方法介绍,1.特异性酯酶CE染色原理,细胞内的氯乙酸萘酚酯酶，在作用液中可以将氯乙酸AS-D萘酚进行水解，释放氯乙酸AS-D与重氮盐偶联产生不溶性有色沉淀，定位于胞质内。 CE通常被看成是粒细胞及肥大细胞的标志酶，分布局限，对粒细胞有较强的特异性。,CE固紫酱GBC法 CE副品红方法,2.正常血细胞染色反应 粒系 原粒细胞呈阴性反应 分化好早幼粒细胞至成熟中性粒呈阳性反应; 嗜酸粒细胞呈阴性或弱阳性反应; 嗜碱粒细胞呈阳性反应。,单核细胞呈阴性或弱阳性反应。 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、巨核细胞和血小板均呈阴性反应。 组织嗜碱细胞呈强阳性反应。,3.临

7、床意义 急性白血病，阳性率强弱的排列顺序为： M3M2bM5M2aM4 M6（粒）MlALL,粒系 原始及早幼粒 细胞一般阴性， 少部分可见弱 阳性反应(+)。,M2b在细胞核的凹陷处呈团块状反应,M3呈强阳性反应。易见柴束样结晶。,单核：阴性或弱阳性，为颗粒状散状分布,ALL CE染色阴性,(Non-Specific Esterase),非特异性酯酶在酸性、中性和碱性pH条件下，水解各种短链脂肪酸酯或芳香族酯。存在于所有血细胞，包括巨核细胞、浆细胞，甚至上皮细胞的溶酶体内。该酶是单核细胞、巨噬细胞的标志酶,分布较广泛。,非特异性酯酶,底物：-醋酸萘酚酯酶(-NAE) 醋酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE) -丁酸萘酚酯酶(-NBE) 重氮盐 坚牢蓝B 固蓝BB 六偶氮付品红,-醋酸萘酚酯酶 -Naphthol acetate esterase，-NAE 1.原理: 在中性条件下，酯酶将醋酸萘酚水解，产生萘酚，在与重氮盐偶联，产生不溶性的有色沉淀。,不加NaF积分值-加NaF积分值 NaF抑制率 = 100 不加NaF积分值 抑制率大于50为抑制 NaF用量15mg10m1作用液。,2

8、.正常血细胞染色反应 粒细胞系:各阶段粒细胞均为-或，随细胞成熟阳性减弱呈阴性，不被氟化钠抑制 单核细胞:阳性反应较强,能被氟化钠抑制。,其它细胞 成熟淋巴细胞部分呈阳性反应，阳性物多表现为颗粒状，不被氟化钠抑制； 巨核细胞和血小板呈强阳性反应； 早期幼红细胞呈阳性反应，随幼红细胞的成熟阳性反应逐渐减弱，不被氟化钠抑制。,NAE正常参考结果,3.临床意义 是单核细胞和巨噬细胞的标志酶,单核细胞系统疾病 原始单核细胞呈阳性，阳性细胞呈局灶型或颗粒型反应；少部分为阴性。 幼稚单核细胞阴性、弱阳性和强阳性。 阳性物颜色鲜艳呈细小颗粒弥散状 加NaF后阳性率及指数明显降低或阴性。,原幼单核细胞NAE染色,M5NAE+NaF染色,粒系统细胞疾病 原始及早幼粒细胞阴性或弱阳性反应，酶型多为弥散型、局灶型，少数可呈颗粒状。 阳性反应不被NaF抑制。,M2aNAE染色,M2bNAE染色,淋巴细胞疾病 阴性或阳性，阳性物可呈颗粒型或局灶型，阳性不被氟化钠抑制。,ALL NAE染色,过氧化物酶染色 过碘酸-雪夫反应 酯酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 铁染色,血细胞含有的磷酸水解酶主要 碱性磷酸酶 ALP

9、 酸性磷酸酶 ACP ALP由许多同工酶组成，在碱性条件下(最适pH为9.39.6)催化各种醇和酚的单磷酸酯。,四、碱性磷酸酶染色,钙钴法 Gomori-Takamaish 偶氮偶联法 底物:磷酸萘酚AS-MX Tomonaga 1963 萘酚AS-BI磷酸钠 Kaplow 1963 -磷酸萘酚钠 重氮盐: 坚固蓝B 固兰RR 固紫B盐,1.染色方法,Kaplow法 中性粒细胞中的碱性磷酸酶在pH9.6水解磷酸萘酚钠，释放萘酚，后者与偶氮盐耦合形成不溶性的染料。,2.染色原理,ALP偶氮偶联法原理,阳性：中性粒细胞的标志酶，ALP的含量以晚幼和成熟粒细胞为最高,原粒ALP反应阴性；网状细胞强阳性。 阴性：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨核细胞、浆细胞及红系细胞。,3.分布,4. 染色分级反应 (-) 0分：阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 (+) 1分：胞浆少量颗粒或呈弥散浅红色。 (+) 2分：胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 (+) 3分：胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核清晰。 (+) 4分：极丰富粗大颗粒，或弥散深色，胞核不清晰。 NAP积分：NAP反应结果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 积分=（020）+（140） + （220）+（315）+（45）=145 阳性率为80%。,细菌感染ALP染色,CML ALP阴性,5.ALP正常范围,阳性率 :40% 阳性指数:30130分,生理变化 年龄：NAP活性在新生儿很高，3个月开始降低，婴幼儿和儿童期仍略高于成年人，60岁以上老年期NAP活性降低。 应激状态 ：恐惧、紧张、妊娠、分娩和剧烈运动等应激状态下NAP活性可增高。 性别：女性男性；经前期行经期,6.临床意义,病理变化： 炎症反应，各种急性化脓性感染，球

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