常用抗生素抑菌机理
3页1、一、潮霉素 B潮霉素 B(Hygromycin B)是由吸水链霉菌( Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过干扰 70S核糖体易位和诱导对 mRNA模板的错读而抑制蛋白合成,从而杀死原核(如细菌)、真核(如酵母菌,真菌)和高等哺乳动物真核细胞。大肠杆菌( Escherichia coli.)来源的潮霉素抗性基因(hyg 或 hph),编码潮霉素 B磷酸转移酶,将潮霉素 B转化成不具有生物活性的磷酸化产物,从而起到解毒作用。针对这一原理,潮霉素 B是一种非常有用的选择性标记,用来筛选和维持培养成功转染潮霉素抗性基因的原核或者真核细胞。另外,由于作用模式的差异,常与 G418 (GeneticinTM),Zeocin 和 Blasticidin S联合使用进行双抗性阳性细胞株的选择。潮霉素 B还能用作抗病毒剂,因其选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞,且具有抑制翻译的功效。还可混合入动物饲料中起到驱虫功能。(使用方法1. 储存液的配制(50mg/ml)称取 0.5g 潮霉素 B加入 10ml无菌去离子水内使其完全溶解。先用 5ml无菌
2、去离子水预湿润 0.22m 针头式过滤器,除尽水。之后使用此滤器过滤潮霉素 B溶液,除菌后分装成单次使用的小量(如 1ml)放到-20冻存,约 1年稳定。2. 常用筛选浓度注意:潮霉素 B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化,推荐使用浓度为 50-1000g/mL。对于第一次使用的实验体系建议通过建立杀灭曲线(kill curve),即剂量反应性曲线,来确定最佳筛选浓度。一般而言,哺乳动物细胞 50-500g/mL;细菌/植物细胞 20-200g/mL;真菌 300-1000g/mL。3. 杀灭曲线的建立注意:为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现,至少选择 5个浓度。1) 第一天:未转化的细胞按照 20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上,37,CO 2培养过夜;注:对于需要更高密度来检测活力的细胞,可增加接种量。2) 根据细胞类型,设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定50,100,250,500,750,1000g/mL。先用去离子水按照
3、1:10的比例将母液稀释到 5 mg/ml,然后按照下表稀释到相应浓度的工作液。)二、G418G418(G-418 即 G-418 sulfate,也称 Geneticin,分子式为C20H40N4O10.2H2SO4,分子量为 692.71 g/mole)是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影响 80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当 neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动 neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有418 的选择性培养基中生长。418 的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。G418和筛选筛选之前由于每种细胞对 G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的相同浓度的 G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定 G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到 1000个细胞/mL,在 100
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