细胞培养操作及其注意事项
12页1、细胞培养操作及其注意事项,易红飞20121116,一 、准备工作,1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌,以酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风扇运转10分钟后,才开始实验操作。2. 从冰箱拿出试剂(培养基,胰蛋白酶,PBS等),放在室温条件下,或37水浴。水浴箱中水应常换,从水浴箱中拿出东西要擦干,喷酒精。3. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如移液器和枪头盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。4. 操作人员应注意自身的安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。用酒精擦拭手套后才可进行操作。5. 实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时,不要同时打开相邻两个房间的门。,二、贴壁细胞的换液及传代,1. 换液当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄,而细胞密度未达到60%左右时,可只考虑换液而暂时不进行传代。吸弃原培养液或直接倒弃,加入新的培养液。注意:对于一些贴壁不牢固的细胞株(如Hela 细胞),加入新培养液时应把枪头
2、贴于器皿壁上缓慢注加,或需要避免更换枪头时,可考虑滴加于器皿壁上,以免把已贴壁的细胞吹起。),2. 传代当细胞密度达到70%-80%时,需要进行传代。吸弃或者倒弃原培养液。加入适量PBS以漂洗除去残余的原培养液。加入适量的胰蛋白酶,混匀后放置培养箱37孵育1-3分钟。观察细胞消化情况。加入完全培养基以终止消化。按比例把细胞传到新的培养皿中。放置细胞培养箱中培养。,注意:判断细胞是否要传代的准则是不能让细胞生长密度大于80%。血清中有抑制胰蛋白酶的成分。加入的胰蛋白酶的量不能太多,只要稍微能覆盖细胞层面即可。若加入的胰蛋白酶较多,会伤害细胞且有可能反而降低消化效率。孵育时间不能过长,否者对细胞照成伤害。一般来说1-3分钟足够,尽量不要超过5分钟。 贴壁较牢固的细胞株(如4T1细胞株),需要孵育时间较长,而贴壁不牢固的细胞株(如Hela 细胞株),需要孵育时间较短。一般来说,细胞生长密度较大时,需要孵育时间较长。不需要专门离心以去除胰蛋白酶,加入完全培养基即可。若需要去除胰蛋白酶,可离心弃上清以除去胰蛋白酶。根据细胞生长速度的不同选择不同的传代比例。尽量不要使用原培养皿,因为经胰蛋白酶处理
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