FLAG标签融合蛋白纯化试剂盒使用说明书
5页1、FLAG标签(DYKDDDDK)融合蛋白纯化试剂盒Cat# : KAP0064(本品仅用于科学研究,不可用于诊断及治疗)1. 背景信息Flag-Tag( DYKDDDDK),常用于真核蛋白质重组表达标记。FLAG标签(DYKDDDDK) 融合蛋白纯化试剂盒,主要成分是An ti-Flag亲和纯化凝胶(An ti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel),由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成,具有高载量 (至少为1.2mg protein/ml凝胶),高特异性,性质稳定,可反复使用的特点,可用于Flag 标签融合蛋白的亲和纯化。2. 性能指标应用范围:可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白(Met-Flag-Protein ),N端Flag融合蛋 白(Flag-Protein )和C端Flag融合蛋白(Protein-Flag )的亲和纯化。载量:1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒,共价偶联800pg Anti-Flag兔多克隆抗体,可纯化至 少1.2mg Flag融合蛋白。强度: 重力柱纯化,可反复使用5次以上。保存方
2、法:在加入了 50%甘油和0.2%。叠氮钠的PBS保存液后,预装纯化柱可于-20弋可保存 1年。3. 试剂盒组成组分内容物/配方数量保存预装纯化柱:容积12ml1ml共价偶联Anti-Flag兔多克隆 抗体的Sepharose 4B琼脂糖颗粒, 溶于2ml PBS+50%甘油中1份-20C年细胞裂解液:25ml/瓶50 mM Tris HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, and 1% Triton X-100 (说明见 5.3)2瓶室温一年3 x Flag peptide 洗脱液:1mg/份3xFlag peptide干粉,使用刖溶于10 ml IxPBS,工作浓度为100p g/ml1份4C年酸性洗脱液:25ml/瓶0.15M Argi nin e-HC l 缓冲液,pH3.01瓶4C年中和液:25ml/瓶1M Tris HCl 缓冲液,pH8.01瓶4C年1OxPBS(清洗液/储存液):25ml/瓶1.5M PBS buffer , pH7.5 , with 2%。Azide (使用时须用双蒸水稀 释10倍)2瓶4C年酸性预洗液:25ml/瓶0
3、.15M PBS buffer, pH5.01瓶4C年4. 使用方法4.1细胞裂解液制备4.1.1 悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中, lOOOrpm离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来,放入离 心管中1000rpm离心 5分钟。4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞,1000rpm离心 3min,弃上清。重复一次。4.1.3 根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液, 反复吹打后冰上放置 10-20min,让细胞充分裂解。4.1.4 用超声破碎仪将细胞裂解液超声,直至细胞裂解液透明,不再粘稠。冰上 放置30min之后,12000rpm , 4C离心10min。取上清,冷冻保存。4.2装柱及孵育4.2.1 10ml (10倍柱体积)PBS清洗Anti-Flag亲和纯化柱。4.2.2加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液,室温孵育或者4C孵育过夜。4.2.3 根据蛋白质性质选择洗脱方法,具体可参见第5部分问题和建议5.1。4.3 3xFlag peptide洗脱液竞争洗脱4.3.1用1xPBS酉己制3xFlag peptide洗脱液,终浓度为100pg/ml。4.3
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