凯氏定氮法原理

1、2008 年 09 月 25 日 星期四19:52三鹿奶粉事件让全国人民知道了 三聚氰胺， 食品中蛋白质含量的现行国家标准和国际通行测定方法是经典 凯氏定氮法， 三少 作为一名分析人员，现在将 凯氏定氮法原理，方法步骤和计算方法 写出来，看看 凯氏定氮法在 蛋白质含量中的缺陷。何为凯氏定氮法？简单地说，凯氏定氮法是一种检测物质中“氮的含量”的方法。蛋白质是一种含氮的有机化合物，食品中的蛋白质经硫酸和催化剂分解后，产生的氨能够与硫酸结合，生成硫酸氨，再经过碱化蒸馏后，氨即成为游离状态，游离氨经硼酸吸引，再以硫酸或盐酸的标准溶液进行滴定，根据酸的消耗量再乘以换算系数，就可以推算出食品中的蛋白含量。一. 凯氏定氮法原理 凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜起催化剂的

2、作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将 NH4+转变成 NH3，通过蒸馏把 NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红- 次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。反应式如下：1. 有机物中的氮在强热和 CuSO4，浓 H2SO4作用下，消化生成（ NH4） 2SO4反应式为： H2SO4=SO2+H2O+OR. +O=NH32NH3+H2SO4=(NH4)2SO42. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中反应式为： 2NH4+OH-=NH3+H2ONH3+H3BO3=NH4+H2BO3-3. 再

3、用已知浓度的 HCI 标准溶液滴定，根据 HCI 消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。反应式为： H2BO3-+H+=H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量 约在 1418，平均为 16（质量分数） 。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数，即为蛋白质含量。凯氏定氮装置图1. 安全管 2. 导管 3. 汽水分离管 4. 样品入口 5. 塞子6. 冷凝管 7. 吸收瓶 8. 隔热液套 9. 反应管 10. 蒸汽发生瓶本文为三少综合整理所得，转载请注明源自二. 方法和步骤 （一）消化1、准备 6 个凯氏烧瓶，标号。1、2、 3 号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾- 硫酸铜接触剂，浓硫酸， 30%过氧化氢。 4、5、6 号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6 号烧瓶中加入蒸馏水代替样液，其余所加试剂与 1、2、3 号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量

4、泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸 15min。在消化过程中要随时转动烧瓶， 以使内壁粘着物质均能流入底部， 以保证样品完全消化。 消化时放出的气体内含 SO2，具有强烈刺激性， 因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。（二）蒸馏和吸收蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。1、仪器的洗涤仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在 10%NaOH溶液中，煮约 10min，水洗、水煮 10min，再水洗数次， 然后安装并固定在一只铁架台上。仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤 5min 即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。首先在蒸气发生器中加约2/3 体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的

5、氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能进入反应室， 导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗23 次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸- 指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液中，蒸馏 12min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏12min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。2、无机氮标准样品的蒸馏吸收由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮标准样品进行反复练习，再进行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。取洁净的 100m

6、L锥形瓶五只，依次加入 2%硼酸溶液 20mL，次甲基蓝 - 甲基红混合指示剂（呈紫红色） 34 滴，盖好瓶口待用。取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3 次，一并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30 NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸 - 指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏 35min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏 1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可进行下一个样品的

7、蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵进行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。3、未知样品及空白的蒸馏吸收将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。加 5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯 3 次，每次用水量约 3mL，洗涤液一并倒入反应室内。 其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水 5 mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。（三）滴定样品和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以 L 的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。三. 结果与计算 运算下列公式计算出每次无机氮标准样品和未知样品的总含氮量。式中WN每毫升样品的含氮毫克数；A滴定样品消耗的盐酸量（mL）；B滴定空白消耗的盐酸量（mL）；C测定样品所取用量（mL）；标准盐酸物质的量浓度（mol/L ）；每摩尔氮原子质量（g/mol ）。三次样品测定的含氮量相对误差应小于2%。样品粗蛋白含量总氮量为含氮量换算为蛋白质含量的系数。. 这个系数来自蛋白质平均含氮量为16，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含氮量不完全相同。乳类为，大米为，花生为等本文为三少综合整理所得，转载请注明源自凯氏定氮法的缺陷：从凯氏定氮原理可以知道：凯氏定氮法是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来进行检测，以得到含氮量的测定值乘以一定系数得出蛋白质含量。而含氮有机物不仅仅是蛋白质，还有 三聚氰胺 等等。在加上食品中蛋白

《凯氏定氮法原理》由会员re****.1分享，可在线阅读，更多相关《凯氏定氮法原理》请在金锄头文库上搜索。