免疫学实验
7页1、实验一 凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等 )与相应抗体结合后,在有适量电解质存在 下,抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块,称为凝集反应 (Agglutination reaction) 或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原(Agglutinogen ),抗体称为凝集素 ( Agglutinin )。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷, 在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状 态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合,形成抗原抗体复合物,降低了抗原 分子间的静电排斥力,此时已有凝集的趋向,在电解质(如生理盐水)参与下,由于 离子的作用,中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷,使之失去了彼此间的静电排 斥力,分子间相互吸引,凝集成大的絮片或颗粒,出现了肉眼可见的凝集反应。根据 是否出现凝集反应及其程度,对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类, 本实验主要介绍直接凝集反 应。目的要求1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。材料与试剂1.
2、 玻板,载玻片,试管(1cm x 8cm ),试管架,刻度吸管,滴管,微量可调加样器,滴头(tip头),牙签或火柴棒,记号笔。2. 灭菌的生理盐水,灭菌的 0. 5%石炭酸生理盐水。3. 布氏杆菌病试管凝集抗原,布氏杆菌病平板凝集抗原,布氏杆菌病虎红平板 凝集抗原,布氏杆菌病阳性血清,布氏杆菌病阴性血清,被检血清(牛、羊或猪) 。4. 鸡白痢平板凝集抗原,鸡白痢阳性血清,鸡白痢阴性血清,被检鸡血清。实验内容及操作方法 (一)试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1. 试管准备:每份血清用试管 4支,另取 3支试管作为对照,作好标记,置试管架上。如被检血清有多份,对照只需做 1份。2. 被检血清稀释:第 1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水,第 2、3、4管加 入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水;然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清 0.2 ml , 加入第1管中,反复吹吸 5次混匀,吸取1.5 ml 弃之,再吸取0.5 ml 加入第2管中, 混匀后吸取 0.5 ml 加入第3管,依此类推至第 4管,混匀后吸弃 0.5 ml (见表 1-1) 该被检血清的稀释度分别是
3、 1:12.5、1:25、1:50、1:100。3. 对照管制作:第 5管中加 0.5% 石炭酸生理盐水 0.5 ml ,第6管加1:25稀 释的布氏杆菌病阳性血清 0.5 ml ,第 7管加 1:25 稀释的布氏杆菌病阴性血清 0.5ml 。4. 加抗原:将布氏杆菌病试管凝集抗原用 0.5% 石炭酸生理盐水作 1:20稀释, 每支试管加 0.5 ml 。表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表(单位: ml )试管号最终血清稀释度0.5%石炭酸生理盐水被检血清抗原(1: 20):251: 501: 1001: 2002.30.5 0.5?0.5 i、 I卜、 J0.20.50.50.50.510.50.50.51阳性血清阴性血清1: 251: 250.50.50.50.50.50.5弃0.5弃1.55. 感作(反应):7支试管加完抗原后,充分混匀,置于 37C温箱中4-10h,取 出后置室温18-24h (或37C温箱12-14h,取出后置室温2-4h;或37C温箱中22-24 h取出),然后观察并记录结果。6. 结果判定:判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、
4、抗原被凝集的程度及凝集块的形状,来判定凝集反应的程度。:100抗原凝集,上清液完全透明,菌体完全被凝集呈伞状沉于管底, 振荡时,沉淀物呈片状、块状或颗粒状。:75抗原凝集,上清液略呈混浊,菌体大部分被凝集沉于管底,振荡时情况如上。(管底凝集物与 100%凝集时相同,只是上清液稍浑浊)。:50抗原凝集,上清液浑浊半透明,管底有中等量的凝集物(管底有明显 的凝集)。:25抗原凝集,上清液完全浑浊不透明,管底有少量凝集物或凝集的痕迹。:抗原完全未凝集,上清液完全浑浊不透明,但由于菌体的自然下沉,在管底 中央出现规则的菌体自沉圆点,振荡后立即散开呈均匀混浊。7. 判定标准:能使 50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价(或称 滴度)。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于 1:100 ,判为阳性, 1:50 的凝集价判为疑 似反应(可疑);猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于 1:50 ,判为阳性,1:25 的凝集价判为疑似反应(可疑) 。注意事项1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照,以避免假阳性、假阴性的结 果。2. 结果判为可疑时,隔 2-3 周后采血重做。阳性畜群,重
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