包涵体蛋白的分离纯化
3页1、1包涵体蛋白的分离纯化赵玲 0743085096包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性,因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%95%,此外,还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、 RNA、DNA、脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。1. 包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时, 都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋
2、白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体, 一般含有 50%以上重组蛋白 , 其余为核糖体组分、 RNA 聚合酶 , 外膜蛋白等杂蛋白, 以及质粒 DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分 。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点:蛋白合成速度太快 , 以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明: 蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应, 因此 , 折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大; 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白, 由于缺少真核生物的翻译后修饰系统( 如糖基化等 ) ,致使中间体大量积累 , 容易形成包涵体 ; 培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成, 如发酵温度高 , 胞内 pH 接近蛋白的等电点等 ; 二硫键在蛋白折叠中有重要作用, 而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成 ; 包涵体不溶可能由于分子间无活性的2 片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然结构、 没
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