鱼粉中真蛋白质

1、鱼粉中真蛋白质（非蛋白氮）的测定方法1、适用范围：本方法适用于饲料级鱼粉中真蛋白与粗蛋白的检验。2、原理 蛋白质在一定碱性条件下，能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于热水， 而非蛋白氮则易溶于水，用热水洗沉淀，将水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凯氏定氮 法测定，得出真蛋白质的含量，再用真蛋白质与粗蛋白质含量之比，可判断出鱼粉中是否掺 入水溶性非蛋白含氮物质。鱼粉真蛋白质比率与指标：鱼粉蛋白质的比率以测得的真蛋白质含量与粗蛋白质含量之比来 表示，粗蛋白质含量应符合产品规定，真蛋白质比率应符合：进口鱼粉中真蛋白质比率不得 小于 80%，国产鱼粉中真蛋白质比率不得小于 75%，鱼粉真蛋白质比率小于上述值时，则 判为该鱼粉中参有水溶性非蛋白含氮物质。3、仪器设备粉碎机、20目分样筛、分析天平（感量O.lmg）、烧杯200m 1、玻璃棒、漏斗（直径10cm）、 定性滤纸（中速，12.5cm, 15cm）、表面皿（直径10cm）、干燥箱（可控温65-70C）、定氮 仪、容量瓶200m 1、锥形瓶200或250m 1、酸性滴定管25ml4、试剂98%浓硫酸、硫酸铜（分析纯）、硫酸铜

2、水溶液（60g/L）、硫酸钾、400g/L氢氧化钠水溶液、12.5g/L 氢氧化钠水溶液、30g/L硼酸水溶液、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（保存期不超过3个月）、 0.5N盐酸溶液、50g/L氯化钡水溶液5、测定步骤5.1试样的处理 称取试样12g（精确到0.1mg）于250ml烧杯中，加蒸馏水100ml煮沸， 加入6%的硫酸铜溶液25ml和1.25%的氢氧化钠溶液25ml,边加边搅拌，加完后继续搅拌1 分钟，从电炉上取下，室温放置2h以上，沉淀物以11cm中速定性滤纸过滤，用70C以上 热水反复洗残渣，直至滤液无硫酸根离子为止（取5%氯化钡试液5滴于表面皿中，加2N盐 酸1滴，滴入滤液，在黑色背景处观察应无白色沉淀）。将滤纸与残渣包好，放入烘箱，在 65-75C干燥2小时。5.2 试样的消化 将烘干的试样连同滤纸一起放入消化管中，以下操作同粗蛋白质的测定。5.3 空白测定： 除不加试样外其余同真蛋白质的测定。6、计算：真蛋白质含量的计算同粗蛋白质含量计算公式：真蛋白质含量真蛋白质比率（） =x100粗蛋白质含量或者用下边的方法：先测出粗蛋白，再用 TCA 分离可溶蛋白（1）称0.5g

3、左右的干燥试样放入125ml的锥形瓶中 加入50ml蒸馏水，静置30分钟 加入10ml10%的三氯乙酸，静置20-30分钟（4）用 54 或者 541 目的滤纸过滤（5）用三氯乙酸溶液冲洗锥形瓶两次（6）把残渣转移至凯氏管内测定其氮得到 NPN用CP-NPN就可以得到真蛋白饲料特别是植物性饲料中含量较多的非蛋白氮化合物如氨化物不能或不能完全 被单胃动物（如猪、禽等）利用，只有真蛋白质才能被单胃动物消化、吸收与利用。 因此饲料真蛋白质含量比饲料粗蛋白含量更能反映出饲料的营养价值。下面介绍 饲料中真蛋白质含量的测定方法。一、原理蛋白质在一定碱性条件下能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀此 沉淀物不溶于热水。而非蛋白氮类物质易溶于水。用热水洗涤沉淀将水溶性含 氮物质洗去，剩下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料真蛋白质的含 量。二、测定所需的材料1仪器和设备实验室用台式粉碎机、分样筛（20目）、分析天平（感量0. lmg）、烧杯 （250ml）、玻璃棒、玻璃漏斗、中速定量滤纸（直径15cm）、表面皿（直径10cm）、 干燥箱（可控温度6570C）、凯氏烧瓶（100ml）、烧煮炉或电炉、半

4、微量定氮蒸 馏器、容量瓶（100ml）、锥形瓶（250ml）、酸式滴定管（50ml）。2. 试剂与试液硫酸AR、10%硫酸铜水溶液、硫酸钾或无水硫酸钠AR、氢氧化钠AR、 40氢氧化钠水溶液、 2. 5氢氧化钠水溶液、 2 硼酸水溶液、 0. 05mo 盐酸标准溶液、氯化钡试液、 5%氯化钡水溶液、 0. l% 甲基红乙醇溶液、 0. 5% 溴甲酚绿乙醇溶液。三、样品的选取与制备取有代表性的样品约lkg。用四分法分为两份。一份装瓶加封作为留用 样品。另一份粉碎过20目。装于广口瓶中贴标签待测。四、测定步骤1试样的前处理准确称取试样l2g（精确到0. lmg）于250ml烧杯中，加蒸馏水50ml 煮沸.依次加入10%硫酸铜水溶液20ml和25%氢氧化钠溶液20rnl,边加边搅 拌，加完后继续搅拌几分钟。放置2小时或静置过夜，沉淀物以中速定量滤纸过 滤。用70C以上热水18ml反复洗涤沉淀.直至滤液无沉淀为止（取氯化钡试液 滴于表面皿中。加2mol / l盐酸溶液1滴.滴人滤液.在黑色背景下观察应无白 色沉淀）。然后，将滤纸和沉淀物包好，放人烘箱中在6570C下干燥2小时。2. 试样的消化

5、将烘干的试样连同滤纸一起放人凯氏烧瓶中.依次加入硫酸钾或无水硫 酸钠9硫酸铜1浓硫酸25ml，摇匀，尔后置于电炉上先低温（100200C）加热， 注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后再提高加热温度（约410C）至沸腾，消化至溶 液澄清无黑点并呈蓝绿色，再继续加热 30分钟，然后将凯氏烧瓶移出电炉放冷。3. 定容将冷却后的消化液加蒸馏水约1020ml，摇匀后转入100ml容量瓶中， 再加1020ml蒸馏水洗涤凯氏烧瓶。溶液并入容量瓶中，如此反复洗涤，直至 消化液全部转入容量瓶中。待冷却至室温后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。即为 试样分解液。4. 蒸馏采用半微量凯氏定氮蒸馏法。先将水蒸汽发生器与半微量凯氏定氮蒸馏 器连接好。在水蒸汽发生器的水中加入甲基红指示剂 3 滴与硫酸数滴，使水溶液 保持橙红色，否则应补加少许硫酸。取20ml2%硼酸水溶液于250ml锥形瓶中， 加0. 1%甲基红乙醇溶液56滴， 0. 5%溴甲酚绿乙醇溶液23滴，摇匀。 然后将锥形瓶置于半微量凯氏定氮蒸馏器的末端.使冷凝管末端浸入此吸收液面 下2/3处。准确移取试样分解液1015ml注入半微量定氮蒸馏器中，用少量蒸 馏水冲洗

6、进样口，尔后缓慢加入40%氢氧化钠水溶液20ml。用少量蒸馏水冲洗 进样口，用玻璃塞塞好进样口。再加适量蒸馏水封住进样口以防止漏气。蒸馏3 5分钟以后待冷凝管末端管口之馏出液呈中性（红色石蕊试纸不变色）时将冷凝管 末端离开吸收液面并冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。再蒸馏12分钟 后用蒸馏水冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。然后将锥形瓶移出，准备滴 定。此时应夹断气源。排出废液，准备下一个样品的测定。5. 滴定吸收氨后的吸收液立即用 0. 05tool/ 1 的盐酸标准溶液滴定使溶液颜色 由蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。同时记录盐酸标准溶液的耗用量。6. 空白 在进行样品测定的同时进行空白测定。空白测定除不加试样外其他操作步骤与试样相同。空白试验消耗的盐酸标准溶液的体积不得超过 05ml。7结果计算五、注意事项1在试样的前处理过程中，“煮沸”要求是加热至沸并保持 30分钟，目 的是使试样中的非蛋白氮类物质充分溶解于水中。加 10硫酸铜溶液和 25氢 氧化钠溶液时最好采用移液管移取，然后沿着烧杯内壁缓慢滴加，一方面防止局 部氢氧化钠太浓将溶解部分蛋白质，这样会导致最终结果偏低；另一方

7、面是为了 使试样中的真蛋白质充分盐析：放置 2 小时或静置过夜也是这个道理。沉淀物宜 以双层中速定量滤纸过滤，双层滤纸可以加快过滤速度，同时又不致于将沉淀物 过滤掉。滤液无S0+2表明了已充分洗涤沉淀物，因为如果滤液中仍有S0+2。 则表明沉淀物中间仍可能夹杂有部分可溶性非蛋白氮类物质（如NH ），若不继续 洗涤则将导致最终结果偏高。将滤纸和残渣（沉淀物）包好放入烘箱中于6570cc 下干燥2 小时是为了使沉淀物充分干燥。一方面是为了避免沉淀物中仍夹杂有一 些氨类物质（尽管这种情况一般不会发生。因为滤液已经过了氯化钡试液的检验， 但仍不能排除因人眼观察的局限性使其中间仍夹杂有部分热烘干的过程中挥发 掉）；另一方面也是为了下一步试样消化的顺利进行。因为如果试样潮湿，炭化 升温过快，气体骤然膨胀不易从凯氏烧瓶中散发出去，很容易使试样与气体一同 冲出凯氏烧瓶从而导致消化失败。2消化时应经常转动凯氏烧瓶以便使消化进行得迅速而完全。在炭化 时如有黑色碳粒溅在瓶壁上应将凯氏烧瓶移出。待冷却后加少量蒸馏水冲洗之。 尔后再继续消化3对胶体物质或脂肪含量较高的样品。消化时应防止泡沫溢出瓶口如 发现有泡沫溢至瓶颈时应立即移开火源，并加12滴蒸馏水再继续消化。4蒸馏过程中要注意气体通路。即管夹要有一个打开，以免烫伤。在 加试样分解液或碱液于反应室时要快。应先检查气源是否夹断。废液流出口是否 畅通。开始蒸馏时应先通蒸汽后夹断废液排出口。否则所加液回流排出。

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