蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案.docx

蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计方案一、 实验目的初步认识化学诱发植物多倍体的过程，学习利用孚尔根反应（染色） 鉴定多倍性细胞的方法二、 实验材料：蚕豆根尖三、 实验药品及工具：生物显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、小玻璃 瓶、小酒杯、培养皿、恒温箱、0.1%-0.2%秋水仙碱溶液、希夫氏试 剂（是一种将碱性复红在酸性溶液中以过剩的亚硫酸（亚硫酸氢钠等） 脱色的试剂）、纯净水、1mol 1-1盐酸等四、 实验原理：多倍体的发生，尤其是异源多倍体的产生是生物进化的重要 途径之一正常细胞的有丝分裂，在中期已复制为两的染色体，都集 中于中央赤道板上，染色单体由于纺锤丝的牵引至后期分别趋向细胞两 级纺锤丝主要化学组成为蛋白质一般认为蛋白质分子中的二硫键 可以被细胞中辅酶的-SH （蔬基）还原，于是由分子内的二硫键转变为 分子间的二硫键，从而使蛋白质分子聚合凡是能抑制巯基作用又能保 持细胞活性的物质，就能阻止蛋白质分子聚合或使已构成纺锤丝的蛋白 质分子间发生解聚作用，致使纺锤丝不能形成或断裂，从而消失，造成 染色单体不能分向细胞两极，细胞质也不分离，复制的染色体仍存在 于一个细胞中，结果染色体倍增。

如果该细胞在下一次细胞分裂时又 经药剂作用，则可产生更高倍数的细胞，（一般成等比级数增加，但 也会出现奇数倍或非整倍现象，且由于药物的毒性作用染色体不会无限 止的增多），这样就形成了多倍性细胞在药剂作用的过程中，由于 同一组织中的不同细胞有丝分裂的不同步性，而出现加倍程度不一的表 现，这种现象称为混倍性（混倍现象）经加倍了的细胞，一旦停止药 剂作用，仍能进行正常的有丝分裂由此而产生的子细胞，一般说都是 多倍性细胞，从这种细胞分化出来的植株，就是多倍体人工诱发多倍 体的方法很多，分为物理的（变温、机械损伤、射线处理等）和化学 的，我们常采用秋水仙素来进行诱导，这是诱发多倍体最有效的方法， 此外还有六氯代苯、a-漠代萘、对-二氯代苯、申苯磺硫苯胺基苯汞（富 民隆的主要成分）等化学物质均有此作用鉴定多倍体，可采用间接和直接的方法间接方法包括形态学和细胞 学的观察，直接法是直接对试材检测染色体的数目一般来讲，多倍 体植物在形态学和细胞学上的特征表现为:气孔、花器、花粉粒、种 子、果实甚至叶片等明显变大，单位面积叶片上的气孔数目减少而密度 降低等考虑到染色体观察、记数较为烦琐，首先对试材从形态学和细 胞学上来初步判断是否为多倍体，然后把初步断定为多倍体的试材再观 察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异，从而最终确定为多 倍体。

五、实验步骤：1、将根长为0.5厘米左右的发芽蚕豆，投入0.2%的秋水 仙碱溶液内，处理3-6小时，取出继续培养24小时以上过程均需在恒温 (25 C 28 C )下进行2、当肉眼可以看到根尖明显膨大时，即可取出冲洗，将膨大的根尖离体 放入0.1%的秋水仙碱溶液中2-3小时，也可用8-羟基喹啉等具有染色体扩散能力的药液处理，纯净水冲洗后用定液固定3、用不同浓度的乙醇洗涤（同有丝分裂），把根尖放入1mol.l-l HCl中60C水解12分钟，注意温度和时间一定要准确，否则影响染色效果4、将水解好的根尖放入盛有希夫氏试剂的小黑瓶中染色 0.5-3小时， 将根尖取出用漂洗液漂洗3次，每次3分钟蒸馏水洗2分钟，45%冰醋 酸压片（方法同有丝分裂），镜检计数染色体必要时进行数码显微摄影保 存染色体图像附录：孚尔根染色法原理：细胞中的DNA受1NHC1 60C水解作用以后，核酸中的嘌吟碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得 自由状态水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫 试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。