体外诊断试剂胶乳比浊法学习.docx

胶乳免疫比浊法相关知识很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技 术人员越来越多本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅：胶乳微球物理吸附： 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白磺酸基微球表面含 带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2,因此在酸性pH保持稳定醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和 蛋白行程共价键羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法这种方法中，微球溶液和含目标蛋 白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物疏水吸附方法 只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球)醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附 结果取决于后来的共价结合虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的 影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会 很高反应步骤：1. 用反应缓冲液系数蛋白到 10mg/ml；2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到 1%；3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。

室温搅拌孵育2hr；4. 离心或超滤，除去未结合蛋白；5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解注意事项：1. 最优蛋白标记量影响因素1) 有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；2) 胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；3) 免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白 加入微球中，并吹打数次如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入微球共价结合抗体方法：一、一步法1. 准备 50mM pH 6.0 的 reaction buffer，醋酸或 MES buffer 更合适2. 用 reaction buffer 溶解抗体，使其浓度为 1mg/mL3. 用 reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为 1% w/v4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟5. 准备浓度为10mg/ml (52umol/mL)的EDC溶液，用前准备，现配现用。

6. 将计算需求量的 EDC 溶液加入到上述微球悬液中 (Note 6).7. 室温下，立即调节pH (Note 7).8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬Note 3 and 4)B. 两步法为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适两步 法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋 白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的B1 简单一步法：1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer,醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer悬浮微球，使其浓度为 1% w/v2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC,室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC,继续室温孵 育 20 分钟Note 7）.3. 离心或超滤,用等体积的包被缓冲液清洗两次微球,最后悬浮在包被缓冲液中 （Note 3）.4. 用包被缓冲液溶解抗体到lmg/mL，包被缓冲液pH7〜9，浓度为50mM〜100mMNote 1）5. 将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中,持续搅拌,室温孵育2~5小时。

（Note 2）.6. 每ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟Note 9）.7. 离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺 （Note 3 and 4）B2. NHS 中间活化酯两步法在此方法中，在EDAC存在下，NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯活化酯比EDC更稳定， 不易水解1. 每ml反应混合物加入以下成分：? 加入DIW，定容最终体积为lml；? 0.1ml 10X 的 MES buffer，ph6.0〜6.5（ 10X 的 buffer 通常用 0.5M）；? 0.1ml 10%的微球（终浓度为1%）；? 0.23ml NHS 水溶液（50mg/mL）; 11.5mg? 一定体积的19.2mg/ml（100mM）的EDAC水溶液；2. 室温下搅拌反应 15〜30min；（Note7）3. 清洗：MES buffer 或 DIW 清洗 两次；（Note3）；4. 用DIW冲悬浮微球到浓度为1%；5. 同时，用包被buffer溶解稀释抗体buffer 一般为ph7~9，50mM~100mM最终的蛋白浓度1mg/mL;6. 清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。

Note 2）注意：此处给出的例子，微球浓度和 蛋白浓度和 buffer 分别为 0.5%（ w/v）， 0.5mg/mL， 25〜50mM） ;7. 室温下搅拌孵育 2hr；8. 每ml反应液中加入2.5ml乙醇胺，室温搅拌孵育10〜30min；9. 清洗： storage buffer 清洗两次 Note 3/4）NOTES:1. reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸 盐缓冲液、MES缓冲液蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多 的疏水位点暴露出来在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上然而，最 终 reaction buffer 的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同 pH的反应buffer应该进行优化选择起始实验，反应buffer的离子强度应该在25〜50mM2. 蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中小体积的话，可以进行斡旋混合 当大体 积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间3. 移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮， 然后搅拌，接着温和的超声分散。

离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散也可以用超滤或透析来纯 化当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜用于清洗微球的buffer应该 和storage buffer 一样用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落4. 微球包被抗体后，加入表面活性剂或者去污活性成分，可能会导致抗体脱落如果是共价结合到微 球上，共价结合的抗体就不会有脱落现象发生圭寸闭蛋白，像BSA，casein或gelatin可以用来圭寸阻任何空 余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集但是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固的抗体洗脱下 来5. 此试剂和水反应，因此，溶解后应立刻使用掉6. EDC 的用量，根据微球表面羧基浓度来计算根据计算所需量，每 mol 的羧基应该再多加 2~3mol 的 EDC 但是，根据功能性检测结果，还需要进一步的优化7. 此步骤，微球的凝集经常能观察到因为接下来的步骤中，EDC会将相邻两个微球上的抗体连接起 来从而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者两者情况都发生调节pH到6.5或超过6.5，优化共价 反应，对微球的分散有帮助如果反应结束后微球凝集现象仍然发生，用新鲜的 buffer 清洗除去多余的 EDC 和游离的蛋白，一般会使得凝集颗粒再分散。

如果在最终的产品中凝集依然发生，尝试稀释微球，一开始 可以稀释到原来的 50%浓度如果稀释后凝集依然发生，可以尝试在所有 reaction buffer 中加入 Tween20 或 Tergitol NP9 等非离子型表面活性剂这些表面活性剂不会干扰颗粒的活性或共价结合，但是需要注意 的是，要确保在这种去污剂存在下微球共价结合的抗体的稳定9. 加入乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应 胶乳标记过程中常见问题：1） 问题：蛋白无法吸附到微球上 解决方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性剂，释放其占据的蛋白结合位点；引入中间物，将微 球与蛋白相连；改变缓冲液2） 问题：标记时加入了大量的蛋白，但是仍然无活性 解决方法：改变蛋白加入量，从而改变蛋白与微球结合的空间构象；使用表位稀释物，占据微球上的部分 蛋白结合位点，防止蛋白靠的太近3） 问题：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集 解决方法：增加蛋白标记量或封闭剂的用量，防止有空余位点；4） 问题：标记后开始活性很好，储存一段时间后，活性降低解决方法：降低储存温度到 2~8 度；降低储存液中的封闭剂浓度，防止抗体被替换；确认储存液中无能与 抗体竞争的杂质，防止长时间取代抗体。

5） PS 微球与蛋白（抗体）交联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集 是偶联效率低的原因当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，由于 这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集可以加一些 blocker agents解决，常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系， 比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合6） 抗体偶联至羧基PS球，即时检测效果很好，但置于37度2天后，抗体活性似乎下降很大可能共价结合未成功，如果是这样，那么最主要的原因是EDAC质量差或过期了EDAC长期放在空气中 会吸潮，水汽会降低EDAC活性另一个可能原因是凝集观察胶乳是否有凝集产生 还有，交联蛋白前有没有清洗？我们提供的胶乳缓冲液中含有表面活性剂，可能干扰抗体的结合如果未 发生凝集，而且用前已经清洗，那么我们建议换新的 EDAC7） EDC 活化羧基乳胶微球后，加蛋白（抗体）即时有沉淀出现，是什么原因？ 很多因素可以导致蛋白加入后，微球聚集成块。

通常，蛋白偶联前的聚集与缓冲液（电解质）有关可能是羧基没有活化好EDC质量出现问题了，请换质量好的再尝试如果没有好的EDC,可以适当调低 活化缓冲液的 pH 值对非修饰微球，那么可以从以下方面着手解决： 绝大多的微球制备过程中，加有脂肪酸乳化剂在聚合时，它起乳化作用，在聚合后，它起稳定剂作用， 使微球以胶体样分布在碱性pH下，微球表面的COOH，脂肪酸分子上的COOH以及聚苯乙烯多聚链末 端的硫酸根（SO42-）使微球表面带负电荷，亲水性增强，从而能形成稳定的胶体由缓冲液导致的聚集可以通过加蛋白，阴离子乳化剂，非离子乳化剂（如Triton X-100和Tween-20）下列方法供参考：a) 加入蛋白前，加少量的乳化剂具体量可以自己摸索掌握，太多的乳化剂可能会占据微球表面，影响蛋 白偶联b) 少数研究人员选择用含少量蛋白的缓冲液冲洗微球(可以降低体系中的离子强度)c) 适当降低缓冲液的浓度，但不能使蛋白变性d) 稀释微球，使微球间距离加大，减少相互结合的机会e) 如果有可能，加大偶联蛋白的浓度f) 偶联时，将微球加入蛋白液中，而不是。